Efeitos do alfa-tocoferol nanoencapsulado com policaprolactona sobre a inflamação e o estresse oxidativo de ratos artríticos

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO: A artrite reumatoide é uma doença inflamatória autoimune e crônica que afeta as articulações e atinge cerca de 1% da população adulta mundial. A fisiopatologia da doença envolve uma intensa hiperplasia das articulações com acentuada produção de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas. A artrite reumatoide é sistêmica e afeta diversos órgãos, como cérebro, pulmão e fígado. A artrite induzida por adjuvante é um modelo experimental em ratos que compartilha muitas características com a artrite reumatoide. Os animais apresentam inflamação sistêmica e, além das articulações, outros órgãos são afetados, como o fígado e o cérebro, onde alterações inflamatórias estão associadas com um acentuado estresse oxidativo. O ?-tocoferol é um dos principais antioxidantes celularer e atua diretamente neutralizando radicais livres. Os níveis de ?-tocoferol estão diminuídos no sangue e no fluido sinovial de pacientes artríticos. Em adição, a suplementação de camundongos artríticos com ?-tocoferol reduz a expressão e os níveis séricos IL-1? e TNF-?. Desta forma, seria possível esperar que a administração de ?-tocoferol diminuísse a inflamação e o estresse oxidativo sistêmico de ratos artríticos e também de pacientes com artrite reumatoide. Entretanto, a natureza lipofílica do ?-tocoferol dificulta sua interação com o ambiente aquoso gastrointestinal e, por isso, diversas formulações têm sido propostas para melhorar a sua biodisponibilidade, dentre elas as nanocápsulas preparadas com poliésteres biodegradáveis, como a poli-?-caprolactona. Por esta razão, este estudo avaliou os efeitos do ?-tocoferol nanoencapsulado com poli-?-caprolactona administrado por via oral sobre a inflamação articular e o estresse oxidativo no sangue, fígado e cérebro de ratos com artrite induzida por adjuvante. Os efeitos foram comparados com aqueles do composto não encapsulado administrado por via oral e intraperitoneal. Por fim, foi avaliado o efeito da associação do ?-tocoferol com zinco sobre os mesmos parâmetros. MÉTODOS: A indução da artrite foi feita em ratos Holtzman adultos (12 meses; 500-550g) com o adjuvante completo de Freund. Dois protocolos de tratamento foram conduzidos: 1) administração intraperitoneal de ?-tocoferol e ?-tocoferol + zinco não encapsulados e 2) administração oral de ?-tocoferol encapsulado e não encapsulado. Para o protocolo (1), os ratos foram divididos em 5 grupos: controles que receberam por via intraperitoneal óleo de milho (C-OM) ou ?-tocoferol + zinco (C-?Zn) e artríticos que receberam óleo de milho (A-OM), alfa-tocoferol (A-?) ou ?-tocoferol + zinco (A-?Zn). Em relação ao protocolo (2), os animais foram divididos em 6 grupos: controles e artríticos que receberam por via oral (gavagem) ?-tocoferol não encapsulado (C-? e A-?), nanopartículas vazias (C-n e A-n) ou ?-tocoferol nanoencapsulado (C-n? e A-n?). Os animais foram tratados diariamente cinco dias antes e mais 18 dias depois da indução da artrite e utilizados no 19° dia. As doses foram 100 mg/Kg de ?-tocoferol e 40 mg/Kg de zinco. As nanopartículas de poli-?-caprolactona contento ?-tocoferol foram preparadas por nanoprecipitação. O volume das patas foi monitorado por plestismografia. As lesões secundárias, o número de leucócitos no sangue e recrutados para cavidade articular femorotibial de ratos artríticos foram também mensurados. No 19° dia, a cavidade peritoneal dos ratos previamente anestesiados foi exposta, o sangue colhido da veia cava e o fígado e cérebro removidos para a preparação do homogenato. Proteínas carboniladas e ROS foram quantificados, respectivamente, no homogenato e no sobrenadante do homogenato, para avaliar o estresse oxidativo hepático e no cérebro. O conteúdo de glutationa oxidada (GSSG) e reduzida (GSH), e a atividade da catalase e superóxido dismutase (SOD) foram determinados no sobrenadante do homogenato. Também foram determinados a capacidade redutora de ferro plasmática (FRAP), tióis e proteínas carboniladas no plasma. RESULTADOS: Os ratos artríticos que não receberam ?-tocoferol (A-OM e A-n) apresentaram uma resposta inflamatória forte ao adjuvante na pata injetada e na pata contralateral. Estes animais também perderam peso corporal e apresentaram manifestações inflamatórias sistêmicas, como evidenciado pelas lesões secundárias à artrite e maior número de leucócitos articulares e circulantes. O estresse oxidativo também foi aumentado sistemicamente nestes animais, como evidenciado por maiores níveis de proteínas carboniladas no plasma, maiores níveis de ROS no fígado e cérebro, diminuída FRAP e reduzida atividade da catalase, GSH e razão GSH/GSSG no fígado e cérebro. O ?-tocoferol administrado por via intraperitoneal na dose de 100 mg/Kg foi efetivo em diminuir a inflamação articular e parte do estresse oxidativo sistêmico na artrite. A efetividade anti-inflamatória pode ser concluída a partir da diminuição do edema de patas, escore artrítico e leucócitos totais articulares nos animais artríticos tratados com ?-tocoferol. Da mesma forma, a efetividade sobre o estresse oxidativo pode ser concluída a partir da diminuição dos níveis de proteínas carboniladas plasmáticas e níveis de ROS no cérebro e fígado, aumenta da FRAP, aumento nos níveis de GSH e razão GSH/GSSG no fígado e cérebro destes animais. O ?-tocoferol administrado por via intraperitoneal e oral não modificou os baixos níveis de tióis plasmático, os maiores níveis de proteínas carboniladas no fígado e érebro, a baixa atividade da catalase no fígado e a perda de peso corporal. Comparado com o ?-tocoferol isolado, a associação com zinco não causou melhoras adicionais na artrite. O ?-tocoferol não encapsulado administrado por via oral na dose de 100 mg/Kg foi efetivo em melhorar alguns parâmetros da artrite, entretanto, o ?-tocoferol encapsulado com poli-?-caprolactona aumentou a sua efetividade. A ação anti-inflamatória pode ser concluída a partir da diminuição do edema de ambas as patas, injetada e contralateral, e diminuição da infiltração de leucócitos em ambas articulações femorotibiais. A maior efetividade sobre o estresse oxidativo pode ser concluída a partir da diminuição dos níveis de proteínas carboniladas no plasma, fígado e cérebro, redução dos níveis de ROS no cérebro e fígado, aumento da FRAP e aumento de GSH e GSH/GSSG no fígado e cérebro. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES: O ?-tocoferol na dose de 100 mg/Kg administrado por via intraperitoneal foi efetivo em diminuir a inflamação articular e o estresse oxidativo sistêmico de animais artríticos. As nanopartículas de poli-?-caprolactona contendo ?-tocoferol foram já caracterizadas e o efeito antioxidante demonstrado in vitro. O presente estudo mostra que a formulação é efetiva in vivo ao diminuir a inflamação e o estresse oxidativo sistêmico de animais com artrite induzida por adjuvante. Um estudo prévio mostrou que a administração subcutânea de ?-tocoferol foi efetiva contra a artrite branda induzida por adjuvante (monoartrite), mas o efeito foi só observado na dose de 600 mg/Kg. A efetividade com uma menor dose (100 mg/Kg) de ?-tocoferol no presente estudo está relacionada com a via de administração utilizada (intraperitoneal) e com a formulação utilizada por via oral. A primeira permite grande absorção de substâncias lipossolúveis e a segunda melhora a solubilidade e o perfil de liberação do ?-tocoferol no trato gastrointestinal. A dose de 100 mg/Kg de ?-tocoferol é ainda elevada para estudos clínicos, mas o uso de poliésteres biodegradáveis para carrear o composto, como a poli-?-caprolactona, podem ser uma importante ferramenta para melhorar a sua biodisponibilidade por via oral e complementar o tratamento da artrite reumatoide

ABSTRACT: BACKGROUND: Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune inflammatory disease that affects primarily the joints and is associated with progressive disability and premature death. The pathophysiology of arthritis involves an intense hyperplasia of synovial membrane with participation of proinflammatory cytokines and overproduction of reactive species, which act as mediators of tissue injury. Rheumatoid arthritis is a systemic disease and many organs are affected, such as brain, lungs and heart. Adjuvant-induced arthritis is an experimental immunopathology in rats that shares many features with rheumatoid arthritis. These animals present systemic inflammation and in addition to joints other organs are affected, as liver and brain, which present inflammatory alterations associated to a pronounced oxidative stress. Alpha-tocopherol is lipophilic cellular antioxidant that acts directly as free radical scavenger. The levels of ?-tocopherol are decreased in blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. In addition, the supplementation of arthritic mice with ?-tocopherol has been shown to reduce both expression and serum levels of IL-1? and TNF-?. Thus, the administration of ?-tocopherol would be expected to decrease inflammation and systemic oxidative stress in arthritic rats and in patients with rheumatoid arthritis. However, the lipophilic nature of ?-tocopherol makes it difficult to interact with the gastrointestinal aqueous environment. Therefore, several formulations have been proposed to improve its bioavailability, including nanoparticles prepared with biodegradable polyesters, such as poly-?-caprolactone. For this reason, this study evaluated the effects of orally administered ?-tocopherol-loaded polycaprolactone nanoparticles on joint inflammation and oxidative stress in blood, liver and brain of rats with adjuvant-induced arthritis. The effects were compared with those of unencapsulated compound orally and intraperitoneally administered. Finally, the effect of ?-tocopherol + zinc on the same parameters was evaluated. METHODS: Arthritis was induced in adult Holtzman rats (12 months; 500-550g) with Freund's complete adjuvant. Two treatment protocols were carried out: (1) intraperitoneal administration of unencapsulated ?-tocopherol and ?-tocopherol + zinc, and (2) oral administration of encapsulated and unencapsulated ?-tocopherol. For protocol (1), rats were distributed into five groups: controls, which corn oil (C-OM) or ?-tocopherol + zinc (C-?Zn) were intraperitoneally administered; and arthritic rats, which corn oil (A-OM), ?-tocopherol (A-?) or ?-tocopherol + zinc (A-?Zn) were intraperitoneally administered. Regarding to protocol (2), animals were distributed into six groups: control and arthritic rats to which empty nanoparticles (C-n and A-n), unencapsulated ?-tocopherol (C-? and A-?), or encapsulated ?-tocopherol (C-n? and A-n?) were orally administered. Animals were treated daily five days before and 18 days after arthritis induction and used on day 19. The doses were 100 mg/kg ?-tocopherol and 40 mg/kg zinc. Polycaprolactone nanoparticles containing ?-tocopherol were prepared by nanoprecipitation. Paw volume was monitored by plethysmography. Secondary lesions, number of leukocytes in the blood and those recruited to the femorotibial joint cavities were also measured in arthritic rats. On day 19, the peritoneal cavity of previously anesthetized rats was exposed, blood was collected from the cava vein, and the liver and brain removed for homogenate preparation. The levels of protein carbonyl groups and reactive oxygen species (ROS) were quantified, respectively, in the homogenate and homogenate supernatant to evaluate hepatic and brain oxidative stress. The levels of oxidized (GSSG) and reduced (GSH) glutathione, and the activity of catalase and superoxide dismutase (SOD) were determined in the homogenate supernatant. The ferric reducing ability of plasma (FRAP), thiols groups and protein carbonyl groups were additionally accessed in the plasma. RESULTS: Arthritic rats to which corn oil (A-OM) or empty nanoparticles (A-n) were administered showed a strong inflammatory response to adjuvant in both the injected and contralateral paws. These animals also lost body weight and presented systemic inflammatory manifestations, as evidenced by secondary lesions to arthritis and higher number of articular and circulating leukocytes. Oxidative stress was also increased systemically in these animals, as evidenced by the higher levels of protein carbonyl groups in the plasma, higher levels of ROS in the liver and brain, decreased FRAP and reduced catalase activity, GSH content and GSH/GSSG ratio in the liver and brain. Intraperitoneally administered ?-tocopherol at the dose of 100 mg/kg was effective in decreasing joint inflammation and part of systemic oxidative stress in arthritis. The anti-inflammatory effectiveness may be concluded by lower paw edema, arthritic score and total articular leukocytes in arthritic animals to which ?-tocopherol was administered. Similarly, the effectiveness on oxidative stress may be concluded from the lower levels of protein carbonyl groups in the plasma and ROS in the brain and liver, increased FRAP, increased levels of GSH and GSH/GSSG ratio in the liver and brain of these animals. Intraperitoneal (as well as oral) ?-tocopherol did not modify the low levels of plasma thiols, the high levels of protein carbonyl groups in the liver and brain, the low activity of catalase in the liver and the loss of body weight. When compared with ?-tocopherol isolated, its association with zinc did not cause further improvements in arthritis. Unencapsulated ?-tocopherol orally administered at the dose of 100 mg/kg was effective in improving some arthritis parameters, however, polycaprolactone-encapsulated ?-tocopherol increased its effectiveness at the same dose. The anti-inflammatory action can be concluded by lower edema of both the injected and contralateral paws and lower leukocyte infiltration in both femorotibial joints. The greatest effectiveness on oxidative stress can be concluded from the lower levels of protein carbonyl groups in the plasma, liver and brain, lower levels of ROS in the brain and liver, increased FRAP, and higher GSH levels and GSH/GSSG ration in the liver and brain. DISCUSSION AND CONCLUSION: Intraperitoneally administered ?-tocopherol at a dose of 100 mg/kg was effective in improving the joint inflammation and systemic oxidative stress of arthritic animals. Alpha-tocopherol carried into polycaprolactone nanoparticles has already been characterized and the antioxidant effect demonstrated in vitro. The present study shows in addition that this formulation is effective in vivo by decreasing inflammation and systemic oxidative stress in rats with adjuvant-induced arthritis. Previous study showed that subcutaneous administration of unencapsulated ?-tocopherol was effective against adjuvant-induced mild arthritis (monoarthritis), but the effect was only verified at the dose of 600 mg/kg. The effectiveness with a lower dose (100 mg/kg) of ?-tocopherol in the present study is related to the route of administration (intraperitoneal) and the formulation orally used. The first allows high absorption of lipophilic substances and the second improves the solubility and release profile of ?-tocopherol in the gastrointestinal tract. Alpha-tocopherol at the dose of 100 mg/kg is still high for clinical studies, but the use of biodegradable polyesters to carry the compound, such as poly-?-caprolactone, may be an important tool to improve its oral bioavailability and to complement the treatment of rheumatoid arthritis