Estresse salino : efeitos sobre o metabolismo dos fenilpropanoides em colmos de milho

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: As paredes celulares vegetais são essenciais para o crescimento, desenvolvimento e manutenção das plantas, principalmente por conferir suporte mecânico, forma, comunicação e permeabilidade seletiva. Elas são compostas principalmente de uma combinação de polissacarídeos, proteínas estruturais, compostos fenólicos, sais minerais, enzimas e água. Os polissacarídeos de parede celular consistem em celulose (20-40%), hemiceluloses (15-25%) e pectinas (~30%), e em parede celular secundária, além dos polissacarídeos, há também a presença significativa de lignina. Estes componentes da parede formam um arranjo altamente ordenado e dinâmico, podendo se tornar mais rígido ou mais frouxo de acordo com as necessidades da planta. O milho possui parede celular primária tipo II e sua principal hemicelulose é o glucuronoarabinoxilano (GAX), que possui uma extensa ramificação com ácido ferúlico, um composto relacionado à lignina que desempenha um papel importante na resposta ao estresse. Os fenilpropanoides são um grupo diversificado de compostos secundários derivados do esqueleto de carbono da fenilalanina, incluindo monômeros de lignina (siringil (S), guaiacil (G) e p-hidroxifenil (H)) e ácidos hidroxicinâmicos, como o ácido ferúlico e p-cumárico. Estes compostos secundários estão envolvidos na defesa, suporte estrutural e sobrevivência das plantas. A lignina é um heteropolímero aromático concentrado em tecidos relacionados à condução de solutos e suporte mecânico, podendo representar até 30% de toda a biomassa lignocelulósica produzida no planeta. O ácido ferúlico pode ser um metabólito intermediário da biossíntese dos monolignois de lignina, e também atuar na função estrutural participando da organização e rigidez da parede celular, sendo capaz de polimerizar com outros compostos fenólicos e interligar polímeros como a lignina com hemiceluloses e pectinas. Em gramíneas, o ácido ferúlico esterificado ao GAX, pode afetar a recalcitrância da parede celular. Além disso, o ácido ferúlico tem funções em atividades biológicas, como proteção contra o estresse oxidativo e radiação UV. As enzimas cafeato 3-O-metiltransferase (COMT) e a coniferaldeído desidrogenase (CALDH) são responsáveis pela formação de ácido ferúlico, além disso, a CALDH pode participar do processo de detoxicações de aldeídos tóxicos liberados sob condições estressantes. A salinização terrestre e hídrica é um dos principais fatores ambientais que limitam o crescimento e a produtividade das plantas. O excesso de sais afeta negativamente a germinação, todos os estágios do desenvolvimento, produtividade e nos casos mais graves causam a morte da planta. A alta salinidade causa primariamente toxicidade celular com estresse tanto hiperiônico quanto hiperosmótico, e os efeitos secundários incluem aumento do estresse oxidativo, danos aos componentes celulares, como membranas, lipídios, proteínas e outros, e disfunção metabólica. O estudo do estresse salino pode beneficiar programas de pesquisas de tolerância aos estresses abióticos direcionados a cultivares resistentes, aumentando assim a produtividade de cultivares em concentrações salinas elevada. O objetivo deste trabalho de pesquisa foi cultivar plantas de milhos por 17 dias após a germinação (DAG) sob condições de estresse salino 0 e 200 mM de NaCl, a fim de investigar no colmo os processos relacionas à adaptação ao estresse tais como: parâmetros biométricos, lignificação, feruloilação, peroxidação lipídica, atividade da COMT e CALDH, teor de carboidrato e proteína solúvel. MÉTODOS: Plantas de milho foram cultivadas em 0 e 200 mM de NaCl DAG. Análises biométricas foram realizadas no colmo avaliando comprimento, diâmetro, biomassa fresca/seca e teor relativo de água (TRA) em relação ao controle. Avaliou-se o teor de lignina pelo método de brometo de acetila em um espectrofotômetro e a composição monomérica pelo método de oxidação com nitrobenzeno em um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC). Os teores de ácido ferúlico e ácido p-cumárico foram avaliados por extração metanólica e quantificados por HPLC. As avaliações de peroxidação lipídica (malondialdeído – MDA), proteína (método Bradford) e carboidrato (método fenol-sulfúrico) também foram realizadas em espectrofotômetro. As enzimas cafeato 3-O-metiltransferase (COMT) e coniferaldeído desidrogenase (CALDH) tiveram suas atividades avaliadas em HPLC. As análises estatísticas foram realizadas pelo teste t-Student com o programa GraphPad Prism 5.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO: O tratamento salino causou redução de 17% no comprimento do colmo e 22,97% no diâmetro, e consequentemente, houve uma redução na biomassa fresca e seca em 51,71% e 15,38%, respectivamente. Isso porque, a alta salinidade afeta negativamente todas os estádios de desenvolvimento das plantas, causada pela redução do potencial osmótico e pela toxicidade dos íons acumulados dentro da célula. Com a redução do potencial osmótico e consequentemente a diminuição da capacidade de absorção água da solução nutritiva do substrato, o TRA reduziu em 3,86%. O nível de malondialdeído (MDA), que é um indicador de estresse oxidativo, aumentou em 314,84%, o que significa que o tratamento salino aumenta a degradação oxidativa das membranas lipídicas devido ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs). Além do estresse oxidativo, outros danos ocorrem devido aos efeitos tóxicos de íons específicos que podem inibir a síntese ou desnaturar proteínas, perturbar a estrutura de enzimas e outras macromoléculas, e várias outras injurias celulares. Isso pode explicar, então, a redução de proteínas solúveis de 22,56% e o aumento de carboidratos solúveis de 243,82%, onde possivelmente enzimas que degradam carboidratos foram inibidas ou desnaturadas. O teor de lignina total aumentou em 6,73% no tratamento salino, pois a lignificação da parede celular secundária é uma das respostas da planta à adaptação de estresses ambientais, o que limita a expansão da célula pelo enrijecimento da parede celular. O conteúdo de ácido ferúlico solúvel apresentou um aumento de 153,58%, o que pode estar associado a ser um intermediário da biossíntese de monolignois da lignina e ter a função de proteção contra o estresse oxidativo. O ácido ferúlico esterificado à parede celular aumentou em 17,52% devido também à sua função estrutural, participando da organização e rigidez da parede celular, interligando polímeros como a lignina com hemiceluloses e pectinas. A análise dos monômeros de lignina mostrou um aumento do monômero G em 5,56%, o que pode estar relacionado ao aumento do ácido ferúlico solúvel, devido ao fato de o ácido ferúlico estar na rota de síntese do álcool coniferílico na via dos fenilpropanoides, onde possivelmente pode levar a um desvio de intermediários precedendo a síntese do monômero H, que foi reduzido em 17,68%. O conteúdo de ácido p-cumárico solúvel aumentou em 14,08%, pois também é um intermediário na biossíntese de monômeros de lignina, e o ácido p-cumárico esterificado na parede celular foi reduzido em 39,11% e pode estar associada à modificação da parede celular em resposta ao estresse por mecanismos ainda não compreendidos. As análises enzimáticas mostraram um aumento na atividade da COMT em 37,54% e CALDH em 45,45%. Ambas as enzimas mostraram-se responsivas ao estresse salino, devido participar da formação do ácido ferúlico e, além disso, a CALDH também é descrita na atuação em processos de tolerância à estresses abióticos, uma vez que pode atuar no ajuste osmótico e detoxificação pela degradando de aldeídos tóxicos reativos. CONCLUSÃO: O estresse salino afeta o crescimento e desenvolvimento vegetativo. Em resposta ao estresse, as enzimas COMT e CALDH foram muito responsivas com um papel importante nos processos de detoxificação, síntese de ácido ferúlico e lignificação das paredes secundárias, sendo etapas importantes na adaptação da planta ao estresse salino. No entanto, o ácido ferúlico e a lignina foram responsáveis pelo aumento da recalcitrância da parede celular e afetou o crescimento e desenvolvimento da planta

ABSTRACT: INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Plant cell walls are essential for the growth, development and maintenance of plants, mainly by providing mechanical support, shape, communication and selective permeability. They are composed mainly of a combination of polysaccharides, structural proteins, phenolic compounds, mineral salts, enzymes and water. Cell wall polysaccharides consist of cellulose (20-40%), hemicelluloses (15-25%) and pectins (~ 30%), and in secondary cell wall, in addition to polysaccharides, there is a significant presence of lignin. These wall components form a highly ordered and dynamic arrangement, which may become stiffer or looser according to the needs of the plant. Maize has a primary cell wall type II and its main hemicellulose is glucuronoarabinoxylan (GAX), which has an extensive branching with ferulic acid, a compound related to lignin that plays an important role in the response to stress. Phenylpropanoids are a diversified group of secondary compounds derived from the phenylalanine carbon skeleton, including lignin monomers (syringyl (S), guaacyl (G) and p-hydroxyphenyl (H)) and hydroxycinnamic acids such as ferulic acid and p- coumaric. These secondary compounds are involved in the defense, structural support and survival of plants. Lignin is an aromatic heteropolymer concentrated in tissues related to the conduction of solutes and mechanical support, being able to represent up to 30% of all the lignocellulosic biomass produced in the planet. Ferulic acid ([3-methoxy-4-hydroxy-3-phenyl-2-propenoic acid)] may be a metabolite intermediary to the biosynthesis of lignin monolignes and also act on structural function by participating in the organization and rigidity of the cell wall, being able to polymerize with other phenolic compounds and to interconnect polymers such as lignin with hemicelluloses and pectins. In grasses, ferulic acid esterified to GAX, can affect the recalcitrance of the cell wall. In addition, ferulic acid has functions in biological activities, such as protection against oxidative stress and UV radiation. The enzymes caffeate 3-O-methyltransferase (COMT) and coniferaldehyde dehydrogenase (CALDH) are responsible for the formation of ferulic acid, in addition, CALDH can participate in the process of detoxification of toxic aldehydes released under stressful conditions. Terrestrial and water salinization is one of the major environmental factors limiting plant growth and productivity. Excess salts negatively affect germination, all stages of development, productivity and in the most severe cases cause death. High salinity primarily causes cellular toxicity with both hyperionic and hyperosmotic stress, and side effects include increased oxidative stress, damage to cellular components such as membranes, lipids, proteins and others, and metabolic dysfunction. The study of saline stress can benefit programs of studies of tolerance to abiotic stresses directed to resistant cultivars, thus increasing the productivity of cultivars in high saline concentrations. The objective of this research was to cultivate maize plants by 17 DAG under conditions of saline stress 0 and 200 mM NaCl, in order to investigate the processes in the stem related to stress adaptation such as: biometric parameters, lignification, feruloilation, lipid peroxidation, COMT and CALDH activity, carbohydrate content and soluble protein. METHODS: Maize plants were grown at 0 and 200 mM NaCl for 17 days after germination (DAG). Biometric analyzes were performed on the stem evaluating length, diameter, fresh/dry biomass and relative water content (RWC) in relation to the control. The lignin content was evaluated by the acetyl bromide method in a spectrophotometer and the monomer composition by the nitrobenzene oxidation method in a high performance liquid chromatograph (HPLC). The levels of ferulic acid and p-coumaric acid were evaluated by methanolic extraction and quantified by HPLC. The lipid peroxidation (MDA), protein (Bradford method) and carbohydrate (phenol-sulfuric method) evaluations were also performed in a spectrophotometer. The enzymes caffeate 3-O-methyltransferase (COMT) and coniferaldehyde dehydrogenase (CALDH) had their activities evaluated in HPLC. Statistical analyzes were performed using Student's t-test with GraphPad Prism 5.0 software. RESULTS AND DISCUSSION: Salt treatment caused a reduction of 17% in stem length and 22,97% in diameter, and consequently, there was a reduction in fresh and dry biomass by 51,71% and 15,38%, respectively. This is because, the high salinity negatively affects all the stages of development of the plants, caused by the reduction of the osmotic potential and the toxicity of the accumulated ions inside the cell. With the reduction of the osmotic potential and consequently the reduction of the water absorption capacity of the nutrient solution of the substrate, the RWC reduced by 3,86%. The level of malondialdehyde (MDA), which is an indicator of oxidative stress, increased by 314,84%, which means that saline treatment increases the oxidative degradation of lipid membranes due to the accumulation of reactive oxygen species (ROS). In addition to oxidative stress, other damage occurs due to the toxic effects of specific ions that may inhibit synthesis or denature proteins, disrupt the structure of enzymes and other macromolecules, and various other cellular insults. This may explain, then, the reduction of soluble proteins of 22,56% and the increase of soluble carbohydrates of 243,82%, where possibly enzymes that degrade carbohydrates were inhibited or denatured. The total lignin content increased by 6,73% in the saline treatment, because the lignification of the secondary cell wall is one of the responses of the plant to the adaptation of environmental stresses, which limits the expansion of the cell by the stiffening of the cell wall. The content of soluble ferulic acid showed an increase of 153,58%, which may be associated with being an intermediary of the monolignes biosynthesis of lignin and having the function of protection against oxidative stress. The ferulic acid esterified to the cell wall increased by 17,52% due also to its structural function, participating in the organization and rigidity of the cell wall, interconnecting polymers such as lignin with hemicelluloses and pectins. The analysis of the lignin monomers showed an increase of the G monomer by 5,56%, which may be related to the increase of the soluble ferulic acid, due to the fact that the ferulic acid is in the route of synthesis of the alcohol coniferílico in the path of the phenylpropanoides, where it may possibly lead to a shift of intermediates preceding the synthesis of the monomer H, which was reduced by 17,68%. The content of soluble p-coumaric acid increased by 14,08%, as it is also an intermediate in the biosynthesis of lignin monomers, and p-coumaric acid esterified in the cell wall was reduced by 39,11% and may be associated with the modification of the cell wall in response to stress by mechanisms not yet understood. The enzymatic analyzes showed an increase in COMT activity in 37,54% and CALDH in 45,45%. Both enzymes have been shown to be responsive to salt stress due to the formation of ferulic acid and, in addition, CALDH is also described in the performance of abiotic stress tolerance processes, since it can act on osmotic adjustment and detoxification by degrading reactive toxic aldehydes. CONCLUSION: Saline stress affects vegetative growth and development. In response to stress, the enzymes COMT and CALDH were very responsive with an important role in the processes of detoxification, ferulic acid synthesis and lignification of secondary walls, being important steps in the adaptation of the plant to saline stress. However, ferulic acid and lignin were responsible for the increased recalcitrance of the cell wall and affected plant growth and development