Imobilização covalente de ciclomaltodextrina-glucanotransferase em nanopartículas magnéticas

Abstract

RESUMO: A ciclomaltodextrina-glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das ?-amilases, sendo a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs) por meio de uma reação de ciclização. Devido a sua capacidade de formar complexos de inclusão com uma grande variedade de moléculas, as CDs têm diversas aplicações na indústria química, farmacêutica, cosmética e de alimentos. A complexação confere à molécula encapsulada pela CD, a alteração de algumas de suas características, como volatilidade, solubilidade e estabilidade. Buscando alternativas viáveis para a produção deciclodextrinas, neste trabalho a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em nanopartículas magnéticas, que têm sido reconhecidas como um dos mais atrativos métodos para imobilização de enzimas, possibilitando maior recuperação e reutilização do biocatalisador. Primeiramente, as nanopartículas magnéticas foram sintetizadas por dois métodos distintos:síntese por coprecipitação e síntese hidrotermal; em seguida, foram caracterizadas por difração de raios X, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Por meio dos espectros de infravermelho e difratogramas obtidos, foi possível observar que a síntese hidrotermal resultou na formação de nanopartículas de magnetita e maghemita, enquanto que na síntese por coprecipitação foram obtidas nanopartículas de magnetita pura. Após a síntese e a caracterização desses suportes, os mesmos foram silanizados com 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTES) e ativados com glutaraldeído, para que fossem geradas condições de imobilização para a enzima CGTase de Bacillus firmus cepa nº 37 e de Thermoanaerobacter sp. (Toruzyme®). As condições empregadas para a síntese, funcionalização e ativação das nanopartículas, aliadas às condições de imobilização das CGTases, proporcionaram de maneirageral, um moderado rendimento de fixação das enzimas ao suporte, elevados valores de recuperação da atividade enzimática, além de boa estabilidade operacional. Os melhores rendimentos de fixação de proteínas foram os obtidos por meio da imobilização das enzimas nas nanopartículas obtidas por síntese hidrotermal (44,08% para Toruzyme® e 45,75% para CGTase cepa nº 37). Com relação à atividade recuperada e estabilidade operacional, a CGTase da cepa nº 37, imobilizada nas nanopartículas magnéticas produzidas por coprecipitação, foi a que apresentou melhor desempenho, com 252,65% de recuperação de atividade após o 12º ciclo de reuso, fornecendo suporte ao relato recente de ativação da CGTase em imobilização semelhante. Tal fenômeno merece destaque e estudos adicionais, uma vez que anteriormente somente se conhecia trabalhos com desativação da CGtase após a imobilização. De acordo com os resultados obtidos, pode-se concluir que os métodos empregados para a síntese das nanopartículas magnéticas mostraram ser eficientes, apresentando baixo custo e simplicidade de preparação, além da formação de nanopartículas magnéticas com tamanho bastante reduzido. O processo de imobilização das CGTases nas nanopartículas magnéticasmostrou ser promissor, proporcionando às enzimas imobilizadas boa estabilidade operacional e recuperação da atividade enzimática, além de fácil recuperação do biocatalisador imobilizado do meio reacional

ABSTRACT: Cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is part of the family of ?-amylases and the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs) by means of a cyclization reaction. Because CDs have the ability to form inclusion complexes with a wide variety of molecules, they have many applications in the chemical, pharmaceutical, cosmetic and food industry. The complexation confers to the molecule encapsulated by the CD, the alteration of some of its characteristics, such as volatility, solubility and stability. Seeking viable alternatives for the production of cyclodextrins, in this work the CGTase enzyme was covalently immobilized on magnetic nanoparticles, which have been recognized as one of the most attractive methods for immobilization of enzymes, allowing greater recovery and reuse of the biocatalyst.First, the magnetic nanoparticles were synthesized by two different methods: synthesis by coprecipitation and hydrothermal synthesis; then they were characterized by X-ray diffraction; scanning electron microscopy (SEM) and infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR).By means of infrared spectra and diffraction patterns, it was observed that the hydrothermal synthesis resulted in the formation of nanoparticles of magnetite and maghemite, whereas synthesis by coprecipitation gave pure magnetite nanoparticles.After the synthesis and characterization of these supports, they were silanized with 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) and activated by glutaraldehyde, producing conditions for immobilizing the CGTasesenzymes from Bacillus firmus strain #37 and Thermoanaerobacter sp. (Toruzyme®).The conditions employed for the synthesis, functionalization and activation of nanoparticles, combined with the immobilization conditions of CGTases, provided in general, a moderate yield of attachment of enzymes to support, high levels of recovery of enzyme activity, and good operational stability. The best yields of fixed proteins were obtained by immobilizing enzymes on the nanoparticles obtained by hydrothermal synthesis (for Toruzyme® 44.08% and 45.75% for the CGTase from Bacillus firmusstrain #37).Regarding therecovered activity and operational stability, the latter CGTase immobilized on magnetic nanoparticles produced by coprecipitation, showed the best performancewith 252.65% recovery of activity after the 12th cycle of reuse and gave support to recent report of a similar CGTaseactivation by immobilization. This phenomenon deserves attention and warrants further study, since all previous published results had shown only deactivation of CGTase after immobilization.According to the results, one can conclude that the methods employed for the synthesis of magnetic nanoparticles proved to be efficient, with low cost and simplicity of preparation, besides the formation of magnetic nanoparticles with greatly reduced size.The immobilization process of CGTases in magnetic nanoparticles has shown promise, providing enzymes immobilized with good operational stability and recovery of enzyme activity, as well as easy recovery of immobilized biocatalyst from the reaction medium