Infecção oral crônica com oocistos de Toxoplasma gondii desencadeia alterações inflamatórias no íleo e cólon de camundongos C57BL/6Infecção oral crônica com oocistos de Toxoplasma gondii desencadeia alterações inflamatórias no íleo e cólon de camundongos C57BL/6

Abstract

RESUMO: Introdução: Após a inoculação oral pelo Toxoplasma gondii,o trato gastrointestinal é o primeiro a interagir com o parasito, pois este invade o epitélio intestinal, se multiplica-se e se dissemina por outros órgãos,podendo persistir pela vida toda em seu hospedeiro. Desta forma, o T. gondii pode causar reações inflamatórias no intestino infectado. Nosso grupo de pesquisa em Neurogastroenterologia da Universidade Estadual de Maringá vem estudando esses efeitos em diferentes contextos, pelos quais realizou a investigação dos efeitos da infecção aguda e crônica em vários modelos experimentais. Os camundongos C57BL/6 são considerados mais susceptíveis à infecção, e durante a fase aguda desenvolvem uma intensa inflamação intestinal. Entretanto, os efeitos da fase crônica da infecção não são muito conhecidos, especialmente quando oocistos são utilizados como inóculo. Objetivo: Avaliar a resposta tecidual do íleo e do cólon de camundongos da linhagem C57BL/6 após a infecção crônica por oocistos da (cepa ME-49). Materiais e métodos: Foram utilizados 14 camundongos fêmeas da linhagem C57/BL6, provenientes do Biotério do Laboratório de Inflamação, da Universidade Estadual de Maringá - UEM. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos (n=7), um grupo controle (GC) e um grupo infectado (GI). Os pertencentes ao GI receberam por gavagem 1000 oocistos de T. gondii (cepa ME-49), enquanto os pertencentes ao GC receberam apenas solução salina. Os animais foram mantidos por 60 dias em biotério setorial com temperatura (24 ± 2ºC) e foto-período de 12 horas (6h - 18h) controlados, recebendo ração e água ad libitum. Após o período experimental, os animais foram submetidos a eutanasia efoi coletado 1 cm do íleo e do cólon de todos os animais e fixados em paraformaldeído 4% tamponado. Depois de fixados, diafanizados e embebidos em parafina, foram cortados transversalmente de forma semi-seriada de 5 ?m para realização das colorações: Hematoxilina e Eosina (HE), a fim de quantificar os linfócitos intraepiteliais (LIEs), células de Paneth e mensurar a parede intestinal; azul de toluidina, para quantificação de mastócitos totais; ácido periódico de Schiff (PAS), para contagem de células caliciformes produtoras de mucinas neutras; Alcian-Blue (AB 2,5) pH 2,5,para quantificar células caliciformes produtoras de mucinas ácidas não sulfatadas ou sialomucinas; Alcian-Blue (AB 1,0) pH 1,0 para contagem de células caliciformes produtoras de mucinas ácidassulfatadasou sulfomucinas; e Picro Sirius Redcontra-corado com hematoxilina de Harris, para a mensuração da área ocupada pelas fibras colágenas totais, do tipo I e do tipo IIIdentro da parede intestinal. Além disso foi coletado 0,5 cm do íleo e do cólon para determinação da atividade da enzimamieloperoxidase (MPO) e dosagem indireta de óxido nítrico (NO). Também realizamos análises imunohistoquímicas, naqualforam coletados aproximadamente 1,5 cm do íleo e 3 cm do cólon, foram lavados e preenchidos com fixadorparaformaldeído 4%por 6 horas, posteriormente foram abertos pela borda mesentérica lavados em PBS, armazenados em geladeira em solução de azida sódica, e realizadas a microdissecção da parede intestinal para retirada do plexo mientérico de cada animal, no qual os preparados de membrana foram incubados em solução contendo anticorpo anti-?tubulina, utilizado para quantificação da população totalde neurônios. Resultados: A infecção crônica de camundongos C57BL/6 com oocistos de T. gondii não alterou o número das células de Paneth no íleo, nem a morfologia dessas células, tampouco a proporção de células caliciformes em relação ao grupo controle. Por outro lado, observamos um aumento significativo da túnica muscular total e parede total do íleo, além deum aumento significativo da profundidade das criptas em ambos os órgãos. A camada longitudinal e circular da túnica muscular, a tela submucosa e os vilos permaneceram sem alterações significativas no íleo. Em relação aos LIEs os resultados demonstraram que houve aumento expressivo da proporção dessas células no íleo e no cólon dos animais infectados, em relação aos seus respectivos controles. Observamos um aumento significativo dos mastócitos totais nos dois órgãos estudados. Houve aumento significativo da área ocupada pelas fibras colágenas totais e do tipo I apenas no cólon, sem alterações significativas no íleo. Na dosagem bioquímica de mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico (NO) não foram observadas alterações no íleo. Por outro lado, observamos uma diminuição significativa de MPO no cólon infectado. A resposta inflamatória tecidual observada não foi suficiente para provocar alterações quantitativas dos neurônios mientéricos avaliados. Conclusão: Concluímos que a infecção crônica por oocistos de T. gondii(cepa ME-49) em camundongos C57BL/6 fêmeas leva a uma resposta tecidual não intensa no íleo e no cólon, sugerindo a persistência de uma inflamação leve. Se levarmos em consideração a alta prevalência da infecção crônica pelo T. gondii, a persistência do estímulo inflamatório pode contribuir para o desenvolvimento de uma resposta inflamatória semelhante à observada em quadros mais brandos ou moderados de doenças inflamatórias intestinais humanas. Acreditamos que este modelo poderia auxiliar na compreensão da fisiopatologia desses casos, entretanto outros estudos são necessários para melhor caracterizar os efeitos da infecção crônica por este parasito

ABSTRACT: Introduction: After oral infection by T. gondii, the gastrointestinal tract is the first to interact with the parasite, as it invades the intestinal epithelium, multiplies and spreads through other organs, persisting throughout its host. Thus, T. gondii can cause inflammatory reactions in the infected intestine. Our research group in Neurogastroenterology at the State University of Maringá has been studying these effects in different contexts, through which we carried out the investigation of the effects of acute and chronic infection in various experimental models. C57BL / 6 mice are considered more susceptible to infection and during the acute phase they develop intense intestinal inflammation. However, the effects of the chronic phase of infection are not well known, especially when oocysts are used as an inoculum. Objective: To evaluate the tissue response of the ileum and colon of mice of the C57BL / 6 strain after chronic infection by Toxoplasma gondii (ME-49). Materials and methods: 14 female mice of the C57 / BL6 lineage, from the Vivarium of the Inflammation Laboratory, of the State University of Maringá - UEM, were used. The animals were randomly assigned to two groups (n = 7), a control group (CG) and an infected group (GI). Those belonging to the GI received 1000 oocysts of T. gondii (strain ME49) by gavage, while those belonging to the GC received only saline solution. The animals were kept for 60 days in a sectoral vivarium with temperature (24 ± 2ºC) and a 12-hour photo period (6 am - 6 pm), receiving food and water ad libitum. After the experimental period, the animals were euthanized and 1 cm of ileum and colon were collected from all animals and fixed in 4% buffered paraformaldehyde. After fixed, diaphanized and embedded in paraffin, they were cut transversely in a semi-serial 5 ?m shape to perform the stains: Hematoxylin and Eosin (HE), in order to quantify the intraepithelial lymphocytes (LIEs), Paneth cells and measured wall intestinal, toluidine blue, for quantification of total mast cells; Schiff's periodic acid (PAS), for counting goblet cells producing neutral mucins; Alcian-Blue (AB 2,5) pH 2,5, to quantify goblet cells producing non-sulfated acid mucins or sialomucins; Alcian-Blue (AB 1.0) pH 1.0 for counting goblet cells producing sulfated acid mucins or sulfomucins; and the staining of Picro Sirius Redcontrol-stained with Harris hematoxylin, to measure the area occupied by total collagen fibers, type I and type III within the intestinal wall. In addition, 0.5 cm was collected from the ileum and colon to determine myeloperoxidase (MPO) activity and indirect nitric oxide (NO) measurement. We also performed immunohistochemical analyzes, in which approximately 1.5 cm from the ileum and 3 cm from the colon were collected, washed and filled with a 4% paraformaldehyde fixative for 6 hours, subsequently opened by the mesenteric border and washed in PBS, sodium azide solution, and microdissection of the intestinal wall was performed to remove the myenteric plexus of each animal, in which the membrane preparations were incubated in a solution containing anti-?tubulin antibody to quantify the total population of neurons. Results: The chronic infection of C57BL / 6 mice with T. gondii oocysts did not change the number of Paneth cells in the ileum, nor the morphology of these cells, nor the proportion of goblet cells in relation to the control group. On the other hand, we observed a significant increase in the total muscle tunic and total ileum wall, in addition to a significant increase in the depth of the crypts in both organs. The longitudinal and circular layer of the muscular tunic, the submucosal mesh and the villi remained without significant changes in the ileum. Regarding LIEs, the results showed that there was a significant increase in the proportion of these cells in the ileum and colon of infected animals, in relation to their respective controls. We observed a significant increase in total mast cells in the two organs studied. There was a significant increase in the area occupied by total and type I collagen fibers only in the colon, without significant changes in the ileum. In the biochemical dosage of myeloperoxidase (MPO) and nitric oxide (NO), no changes were observed in the ileum. On the other hand, we observed a significant decrease in MPO in the infected colon. The observed inflammatory tissue response was not sufficient to cause quantitative changes in myenteric neurons. Conclusion: We conclude that chronic infection by T. gondii oocysts (strain ME-49) in female C57BL / 6 mice leads to a non-intense tissue response in the ileum and colon, suggesting the persistence of mild inflammation. If we take into account the high prevalence of chronic infection with T. gondii, the persistence of the inflammatory stimulus may contribute to the development of an inflammatory response similar to that observed in milder or moderate cases of inflammatory human intestinal diseases. We believe that this model could assist in understanding the pathophysiology of these cases, however, further studies are needed to better characterize the effects of chronic infection by this parasite