Imobilização covalente em nanopartículas magnéticas das enzimas ciclomalrodextrina-glucanotransferase de Bacillus firmus CEPA 37 e comercial Toruzyme®

Abstract

RESUMO: As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, resultantes da ação da enzima ciclomaltodextrina-glucanotransferase (CGTase - EC 2.4.1.19) sobre o amido e outros homopolissacarídeos de glicose, como o glicogênio. Devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão e modificar as propriedades físico-químicas de diversas moléculas, as CDs possuem inúmeras aplicações industriais. A imobilização da CGTase em nanopartículas magnéticas tem sido proposta como uma alternativa para reduzir o custo de produção de CDs e possibilitar o uso contínuo ou repetido da enzima. Este trabalho teve como objetivos imobilizar covalentemente a CGTase de Bacillus firmus cepa 37 em nanopartículas magnéticas, nas condições de enzima purificada e semipurificada. Para comparação, a enzima comercial Toruzyme® também foi imobilizada pelo mesmo método. As nanopartículas magnéticas utilizadas como suporte foram obtidas por coprecipitação alcalina de íons Fe2+ e Fe3+, o que levou a formação de uma mistura de óxidos de ferro (magnetita, maghemita e goethita), identificados por análises de DRX e FTIR. Parâmetros como o rendimento do processo de imobilização, a recuperação da atividade enzimática específica após este procedimento e a estabilidade no reuso da enzima imobilizada por diversos ciclos consecutivos, também foram avaliados. O maior Rendimento de fixação de proteína na Imobilização foi obtido para a imobilização da CGTase de Bacillus firmus cepa 37 purificada, que apresentou 100% de fixação da enzima no suporte. Para a CGTase de Bacillus firmus cepa 37 semipurificada e a enzima comercial Toruzyme® o rendimento foi de 97,95 e 82,31%, respectivamente. Após 20 ciclos consecutivos de reuso das enzimas imobilizadas, a CGTase cepa 37 purificada conseguiu manter 62,9% da sua atividade inicial, a CGTase cepa 37 semipurificada 62,8% e a Toruzyme® 69,0%. A imobilização permitiu que a produção de ?-CD em 20 consecutivos ciclos reacionais fosse 5 vezes maior para a CGTase cepa 37 semipurificada e 3,5 vezes maior para a Toruzyme®, do que a produção obtida pela mesma quantidade de enzima livre em um ciclo reacional. Contudo, seriam necessários 25 ciclos consecutivos de produção de ?-CD com a CGTase purificada imobilizada para alcançar a mesma produção obtida em um único ciclo de reação com a enzima livre. Considerando que a enzima purificada apresentou elevada estabilidade operacional, novos estudos são sugeridos, como o emprego de um sistema contínuo de produção de CDs ou a utilização de uma maior quantidade de enzima no momento da imobilização

ABSTRACT: Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides, produced by the action of the enzyme cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase - EC 2.4.1.19) on starch and other homopolysacharides of glucose as glycogen. CDs can encapsulate and modify the physicochemical properties of many molecules advantageously; consequently, they have many industrial applications. The immobilization of CGTase in magnetic nanoparticles has been proposed as an alternative to reduce production costs of CDs and to enable continuous and repeated use of the enzyme. The objectives of this work were to covalently immobilize the CGTase of Bacillus firmus strain 37 on magnetic nanoparticles, with the purified and semipurified enzyme, and for comparison, the commercial enzyme Toruzyme® was also immobilized by the same method. The magnetic nanoparticles used as support were obtained by alkaline coprecipitation of Fe2+, and Fe3+ ions, which led to the formation of a mixture of iron oxides (magnetite, maghemite, and goethite), characterized by XRD and FTIR analyses. Parameters such as the protein fixation yield of the immobilization process, the recovery of the specific enzyme activity after this process and the stability in the reuse of the immobilized enzyme in a sequence of several consecutive cycles, were also evaluated. The highest immobilization protein yield resulted for the immobilization of the purified CGTase of Bacillus firmus strain 37, which showed 100% fixation in the support. For the semipurified CGTase of Bacillus firmus strain 37 and Toruzyme® this yield was 97.95 and 82.31%, respectively. After 20 consecutive cycles of reuse of the immobilized enzymes, the purified CGTase was able to maintain 62.9% of its initial activity, the semipurified CGTase 62.8% and Toruzyme® 69.0%. Immobilization allowed a five times higher production of ?-CD after 20 consecutive reaction cycles with the semipurified CGTase strain 37 and 3.5 times higher for Toruzyme® when compared to the production obtained by the same amount of free enzyme in a single reactional cycle. However, the purified CGTase would require 25 cycles of ?-CD production to achieve the same production obtained in a single reaction cycle with the free enzyme The purified enzyme presented the highest operational stability, and then further studies are suggested, such as the use of a continuous system of CD production or the use of a more significant amount of enzyme at the moment of immobilization