Imobilização de lipase de Burkholderia cepacia em argila para aplicação na produção de ésteres etílicos

Abstract

RESUMO: Atualmente existe um grande interesse na busca de processos químicos que maximizem o rendimento na produção de ésteres de etila, de forma sustentável e com menor custo energético. Uma alternativa é o uso de enzimas lipases imobilizadas como catalisadores. As lipases imobilizadas podem atuar nas reações de transesterificação dos triacilgliceróis e esterificação dos ácidos graxos livres e, com isso, matérias-primas não alimentícias e com alto índice de acidez podem ser utilizadas, como é o caso do óleo bruto da polpa de macaúba utilizado neste trabalho, com 51,4 ± 0,1 % em ácidos graxos livres. O tipo do suporte utilizado também exerce influência na imobilização. A argila comercial Spectrogel® (tipo C) do tipo bentonita é organofílica com alta afinidade por compostos orgânicos, possuindo grande potencial para uso como suporte, por ser adsorvente, de baixo custo e possuir grupos reativos OH em sua superfície. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo utilizar a argila comercial Spectrogel (tipo C) como suporte de imobilização da lipase de Burkholderia cepacia (LBC) pelos métodos de adsorção (ADS) e ligação covalente (LC), visando à produção de ésteres de etila. Foi feito um tratamento com hidróxido de sódio (10 %) e ácido clorídrico (3 Mol/L) na argila para retirada de sujidades e para adquirir ou aumentar as propriedades adsortivas. As imobilizações foram realizadas empregando um planejamento fatorial 2³ com triplicata no ponto central para estudar os efeitos das variáveis: atividade oferecida (U/g), pH da solução enzimática e concentração molar do tampão da solução enzimática (Mol/L). A variável resposta foi a atividade da enzima no suporte (U/g), que foi acompanhada por análise de hidrólise do azeite de oliva. A partir da análise estatística dos resultados do planejamento experimental foram determinadas as melhores condições para imobilização que foram as seguintes: pH 7,0 e 0,1 Mol/L para ambos os métodos de imobilização testados. A melhor atividade oferecida foi encontrada por meio de um teste de médias, sendo que para o método de adsorção (LBC-ADS) foi de 5709 U/g e para o método de ligação covalente (LBC-LC) foi de 7600 U/g, com atividades obtidas de 1219,81 ± 7,51 e 1274,89 ± 14,99 U/g, respectivamente. As condições ótimas também foram testadas no suporte de argila sem o tratamento ácido para fins de comparação, no entanto, os melhores resultados foram obtidos com o suporte quando foi submetido a um pré-tratamento. Os biocatalisadores obtidos foram analisados quanto à proteína dessorvida, temperatura e estabilidade térmica. O biocatalisador LBC-ADS sofreu 33,55 ± 1,08 % de lixiviação e o LBC-LC 19,44 ± 2,43 %, em 240 minutos. A melhor temperatura de atividade, assim como a melhor estabilidade térmica, foi obtida a 40 ºC. A partir dos biocatalisadores preparados com a argila Spectrogel® (tipo C) foram realizados experimentos para a produção de ésteres de etila. O maior rendimento na produção de ésteres de etila foi na seguinte condição: 1 % de água (kg/kg de óleo), razão molar óleo e etanol de 1:3 e 15 % de biocatalisador imobilizado (kg/kg de óleo). A temperatura foi fixada em 40 ºC, de acordo com a melhor estabilidade térmica dos biocatalisadores. Foi realizado um ensaio cinético nas condições ótimas obtidas para validar o experimento, o qual já mostrou alto rendimento em seis horas (78,82 ± 2,28 % para LBC-ADS e 89,42 ± 2,65 % para LBC-LC) e equilíbrio da reação em 18 h (84,76 ± 0,36 % para LBC-ADS e 98,05 ± 1,24 % para LBC- LC). A heterogeneidade da reação foi feita nos tempos de 1 h e 12 h de reação, para analisar a interação entre o suporte e a enzima, mostrando que após a retirada dos biocatalisadores com 1h de reação, não houve desprendimento significativo das enzimas para o meio reacional. Em relação à reutilização dos biocatalisadores em seis ciclos, houve queda gradual do rendimento em ésteres para ambos os biocatalisadores, com queda mais acentuada para o biocatalisador LBC-ADS. A perda de atividade foi associada à adsorção dos substratos e produtos no suporte, assim como à lavagem dos biocatalisadores que também pode ter enfraquecido as interações responsáveis pela fixação da enzima ao suporte

ABSTRACT: Currently there is great interest in the search for chemical processes that maximize the yield in the production of ethyl esters, in a sustainable way and with a lower energy cost. An alternative is the use of immobilized lipase enzymes as catalysts. Immobilized lipases can act in the transesterification reactions of triacylglycerols and esterification of free fatty acids and, therefore, non-food raw materials with with a high acidity index can be used, as is the case of the crude oil of the macauba pulp used in this with 51.4 ± 0.1 % in free fatty acids. The type of support used also influences immobilization. The commercial clay Spectrogel® type C of the bentonite type is organophilic with high affinity for organic compounds, having great potential for use as a support, as it is adsorbent, low cost and has reactive OH groups on its surface. In this sense, the present work aimed to use the commercial clay Spectrogel type C as a support for immobilization of the lipase of Burkholderia cepacia (LBC) by the methods of adsorption (ADS) and covalent bonding (BC), aiming at the production of ethyl esters. A treatment with sodium hydroxide (10 %) and hydrochloric acid (3 Mol/L) was carried out on the clay to remove dirt and to acquire or increase the adsorptive properties. The immobilizations were made using a 2³ factorial design with triplicate at the central point to study the effects of the variables: activity offered (U/g), pH of the enzyme solution and molar concentration of the enzyme solution buffer (Mol/L). The response variable was the activity of the enzyme in the support (U/g), which was accompanied by hydrolysis analysis of olive oil. From the statistical analysis of the results of the experimental planning, the best conditions for immobilization were determined, which were as follows: pH 7,0 and 0.1 Mol/L for both immobilization methods tested. The best activity offered was found through a means test, and for the adsorption method (LBC-ADS) it was 5709 U/g and for the covalent bond method (LBC-BC) it was 7600 U/g, with activities obtained from 1219.81 ± 7.51 and 1274.89 ± 14.99 U/g, respectively. The optimum conditions were also tested on the clay support without the acid treatment for comparison purposes, however, the best results were obtained with the support when it was subjected to a pretreatment. The biocatalysts obtained were analyzed for desorbed protein, temperature and thermal stability. The LBC-ADS biocatalyst suffered 33.55 ± 1.08 % of leaching and the LBC-BC 19.44 ± 2.43 %, in 240 minutes. The best temperature of activity as well as the best thermal stability, was obtained at 40 ºC. From the biocatalysts prepared with Spectrogel® type C clay, experiments were carried out for the production of ethyl esters. The highest yield in the production of ethyl esters was in the following condition: 1 % of water (kg /kg of oil), molar ratio of oil and ethanol of 1:3 and 15 % of immobilized biocatalyst (kg/kg of oil). The temperature was fixed at 40 ºC, according to the best thermal stability of the biocatalysts. A kinetic test was performed under the optimum conditions obtained to validate the experiment, which has already shown high yield in 6 h (78.82 ± 2.28 % - LBC-ADS and 89.42 ± 2.65 % - LBC-BC) and reaction equilibrium in 18 h (84.76 ± 0.36 % - LBC-ADS and 98.05 ± 1.24 % - LBC-BC). The heterogeneity of the reaction was made in the times of 1 h and 12 h of reaction, to analyze the interaction between the support and the enzyme, showing that after the removal of biocatalysts with 1 h of reaction, there was no significant detachment of enzymes into the reaction medium. Regarding the reuse of biocatalysts in 6 cycles, there was a gradual decrease in yield in esters for both biocatalysts, with a more pronounced decrease for the LBC-ADS biocatalyst. The loss of activity was associated with the adsorption of substrates and products on the support, as well as the washing of biocatalysts, which may also have weakened the interactions responsible for fixing the enzyme to the support