Engenharia fisiológica da biomassa lignocelulósica : modificando a parede celular com inibidores enzimáticos da via dos fenilpropanoides

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO – Ao longo da história evolutiva da vida no planeta, um dos eventos-chave para a conquista do ambiente terrestre foi o surgimento da via dos fenilpropanoides que permitiu às plantas se estabelecerem em terra firme. As funções dos derivados fenilpropanoides são tão diversas quanto as suas variações estruturais. Eles servem como pigmentos, antibióticos, protetores de radiação UV, repelentes de insetos, moléculas de sinalização. Graças à sua capacidade de se polimerizar, os fenilpropanoides ainda formam as unidades monoméricas da lignina, um heteropolímero dos álcoois coniferílico, sinapílico e p-cumarílico de difícil degradação, encontrado principalmente em paredes secundárias de células xilemáticas. Este polímero aromático confere rigidez e hidrofobicidade aos vasos, possibilitando o transporte de água a longas distâncias e proteção contra o ataque de patógenos e herbívoros, bem como reduzindo a eficiência de processos industriais voltados à sacarificação da biomassa lignocelulósica. Não obstante, modificações que reduzem o conteúdo de lignina, embora promovam a sacarificação, frequentemente reduzem o crescimento das plantas. A parede celular vegetal possui uma arquitetura complexa que se difere nos diversos grupos vegetais. Tal estrutura foi moldada ao longo de ~500 milhões de anos por processos darwinianos de mutação e seleção. Durante esse tempo ocorreu uma corrida armamentista: de um lado as plantas, que têm na parede celular uma fonte de energia e carbono, e de outro os herbívoros e patógenos. As comelinides, grupo de angiospermas que inclui as gramíneas (Poaceae), possuem uma parede celular típica, denominada parede tipo II, que se distingue dos outros grupos vegetais (não-comelinides). A principal distinção é a presença de altas concentrações do ácido ferúlico nas paredes primárias. Este fenilpropanoide aparece esterificado aos arabinoxilanos, a mais abundante hemicelulose nas comelinides. Como os monolignóis, o ácido ferúlico também pode se polimerizar interligando os arabinoxilanos entre si e ancorando-os à lignina. A reticulação dos arabinoxilanos promovida pelo ácido ferúlico está envolvida na cessação do crescimento celular e na defesa contra o ataque de patógenos, por reduzir o acesso de enzimas celulolíticas aos polissacarídeos da parede. Juntamente com a lignina, o excesso de ácido ferúlico também reduz o poder nutricional de forragens e culturas destinadas à produção de biocombustíveis de segunda geração, por outro lado, como não é essencial para o crescimento vegetal, a redução no conteúdo de ácido ferúlico estrutural não afeta a produtividade. Experimentos preliminares realizados em escala laboratorial mostram que a aplicação de inibidores de enzimas envolvidas na síntese do ácido ferúlico pode reduzir seu conteúdo na parede celular tornando-a mais fácil de ser digerida. Um maior aproveitamento da biomassa lignocelulósica pode inclusive reduzir os impactos ambientais causados pela produção agrícola e pecuária. OBJETIVOS – Este trabalho teve como objetivos: 1) avaliar a sacarificação enzimática da biomassa lignocelulósica do milho, após tratamento com o ácido 3, 4-metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido piperonílico (PIP) e daidzina (DZN); 2) avaliar a digestibilidade e a produtividade do capim braquiária após tratamento com inibidores da via dos fenilpropanoides MDCA, PIP e DZN; 3) desenvolver um método mais eficiente para remover açúcares solúveis da biomassa em ensaios de digestibilidade. MÉTODOS – Para ensaios em laboratório, sementes de milho (Zea mays cv.IPR-114) foram semeadas em potes plásticos (400 mL) contendo uma mistura (1:1) de vermiculita/substrato orgânico de origem vegetal e cultivadas por 15 dias em sala de cultivo sob 12 horas de fotoperíodo claro/escuro e temperatura constante (25 °C ±4). As plantas foram regadas a cada dois dias com solução nutritiva de Hoagland e a partir do 7 dia, com solução nutritiva acrescida dos inibidores (MDCA, PIP e DZN). Para os experimentos de aspersão foliar, ao 7° dia de cultivo, as plantas foram borrifadas com solução contendo o inibidor específico mais adjuvante (Aureo®) a 0,5%. Ao 15º dia, as plantas foram coletadas e uma análise biométrica foi realizada. O material foi pesado e levado a estufa a 60 °C para secagem até peso constante. Após secagem completa, todas as amostras foram trituradas em moinho de esfera e reservadas para análises de digestibilidade. Ensaios de campo com milho (Zea mays) foram conduzidos na Fazenda experimental Iguatemi (FEI-UEM). Em duas áreas adjacentes foram feitas aplicações via aspersão foliar em dois tempos diferentes: com 30 e 60 dias após semeadura. Foram utilizados os inibidores MDCA, PIP e DZN. Cada ensaio foi realizado com um número de 5 repetições onde cada parcela (n) consistiu de uma área de 3 m2, separadas por 1 m de área de bordadura. A coleta foi realizada aos 120 dias após germinação. As plantas foram secas em estufa a 60 °C até peso constante. Após secagem completa, todas as amostras foram trituradas em moinho de esfera e reservadas para análises de digestibilidade. Para dois experimentos de campo distintos, utilizamos o capim braquiária (Brachiaria decumbens) em uma área do Centro de Treinamento em Irrigação (CTI) da Universidade Estadual de Maringá (UEM) onde o mesmo já estava plantado. Para o primeiro ensaio, foi realizado uma roçada na área, seguida de limpeza e após 10 dias, através de sistema de irrigação, foi feito aplicação em dose única dos inibidores: (PIP) 0,5 e 1,0 µmol L-1 , e (MDCA) 350 e 700 µmol L - 1. Após 30 dias do tratamento, 1 m2 de cada parcela foi coletado e realizado análises biométricas. O material foi pesado e levado a estufa a 60 °C para secagem até peso constante. No segundo ensaio, a aplicação foi feita 7 dias após roçada seguida de limpeza da área. A aplicação dos inibidores foi realizada via aspersão foliar como se segue: daidzina (0,5 e 1,0 mnol L-1), PIP (1,0 e 2,0 µmol L-1) e MDCA (1,0 e 2,0 mmol L-1). Após 30 dias do tratamento, 1 m2 de cada parcela foi coletado cortando-se cada planta rente ao solo. Com as plantas frescas, foram feitas as análises biométricas. Mais uma vez, o material foi pesado e levado a estufa a 60 °C para secagem até peso constante. Após secagem completa, todas as amostras foram trituradas em moinho de esfera e reservadas para análises de digestibilidade, teor de lignina, ácido ferúlico, ácido cumárico e monômeros. As biomassas de capim braquiária (B. decumbens), do milho (Z. mays) e colmo de cana-de-açúcar (Saccharum sp.) foram lavadas exaustivamente com etanol por dois métodos: o primeiro consiste em incubar a biomassa em etanol a 80 °C em tubo de ensaio por 2 h com agitação periódica, ao final desse período, o sobrenadante é descartado e o procedimento repetido até eliminação completa de açúcares solúveis. O segundo consiste em um sistema de refluxo baseado no método de Soxhlet, que lava múltiplas amostras ao mesmo tempo sem a necessidade de agitação ou troca de etanol pelo operador. RESULTADOS E DISCUSSÃO – A daidzina é um inibidor competitivo da coniferaldeído desidrogenase, enzima responsável pela oxidação do coniferaldeído a ácido ferúlico. No entanto, sua adição ao meio nutritivo in vivo não afetou a digestibilidade da planta. Uma análise do meio nutritivo revelou que glicosidases secretadas pelas raízes do milho degradavam a daidzina à sua forma aglicona (daidzeina) anulando sua atividade inibitória. A aplicação de inibidores de glicosidades, preveniu sua degradação e promoveu a digestibilidade da parte aérea do milho. A aplicação da daidzina por aspersão foliar não promoveu a digestibilidade das plantas em escala laboratorial. O PIP e o MDCA, por sua vez, promoveram aumentos de até 23% na sacarificação da parte aérea do milho quando aplicados por aspersão foliar em escala de bancada. Ensaios em escala agrícola mostraram que a aplicação dos inibidores por aspersão foliar promoveu a digestibilidade das plantas colhidas no ponto de silagem (120 dias). As plantas tratadas com MDCA e PIP 30 DAG tiveram sua digestibilidade aumentada em até 54%. Por sua vez, os tratamentos com daidzina (0,5 e 1,0 mmol L-1) elevaram a digestibilidade da parte aérea do milho em até 87%. O tratamento do capim braquiária em campo por fertirrigação em dose única foi capaz de aumentar significativamente a digestibilidade da biomassa em 29% (PIP 1,0 µmol L-1). Os tratamentos promoveram tendências de aumento na biomassa, expansão foliar, teor de clorofila e produtividade. A significativa redução no conteúdo de ácido ferúlico, o que pode ter contribuído para a expansão foliar, devido ao seu papel no controle do crescimento celular. Os ensaios for aspersão foliar mostraram um aumento na digestibilidade com 4 h de incubação de até 18% nos tratamentos com MDCA e PIP nas menores concentrações e de 15% para o PIP na maior concentração. Após 24 h de digestão, o tratamento com MDCA elevou em 21% a sacarificação, enquanto que o PIP elevou este parâmetro em 16%, ambos nas menores concentrações. O método de extração de sólidos solúveis por refluxo do solvente reduziu o tempo de remoção de açúcares de 18 h para 7 h ou menos, dependendo material. Devido tratar-se de um processo automatizado, sem a intervenção do operador, o método reduziu drasticamente o tempo de operação (pesagem, agitação, manuseio de líquidos). A técnica ainda reduziu o consumo de etanol em 77% e o consumo de energia elétrica em pelo menos 95% (considerando-se as amostras, mais ricas em sólidos solúveis (cana-de-açúcar). CONCLUSÃO – A aspersão foliar dos três inibidores testados foi efetiva na promoção da digestibilidade da biomassa lignocelulósica do milho e do capim braquiária. Dados biométricos revelaram uma tendência consistente de aumento na produtividade com a aplicação dos inibidores. Os tratamentos apresentaram efeitos mais tardios, tanto em milho quanto em capim braquiária. Isto sugere que o efeito promovido pelos tratamentos aumenta com o recrudescimento normal da digestibilidade das plantas com a idade, sobretudo em relação à daidzina. Em nenhum dos tratamentos o conteúdo de lignina foi alterado e, de modo geral, os efeitos sobre a produtividade são inócuos ou benéficos. O sistema de lavagem por refluxo permitiu extração de açúcares solúveis em várias amostras em paralelo, reduzindo substancialmente o consumo de solvente, energia elétrica e o tempo de operação quando comparado ao método tradicional utilizado

ABSTRACT: INTRODUCTION – Throughout the evolutionary history of life on the planet, one of the key events for the conquest of the terrestrial environment was the emergence of the phenylpropanoids pathway, which allowed the plants to settle on dry lands. The functions of the phenylpropanoid derivatives are as diverse as their structural variations. They serve as pigments, antibiotics, UV protectors, insect repellents, signaling molecules and so on. Thanks to their ability to polymerize, phenylpropanoids form the monomer units of lignin, a heteropolymer of the coniferyl, synapyl and p-coumaryl alcohols. Hard to degrade, lignin is found mainly in secondary walls of xylem cells where it confers rigidity and hydrophobicity to the vessels, allowing the transport of water over long distances and protection against the attack of pathogens, herbivores as well as reducing the efficiency of industrial processes aimed at the saccharification of the lignocellulosic biomass. However, modifications that reduce lignin content, while promoting saccharification, often reduce plant growth. The plant cell wall has a complex architecture that differs in the various plant groups. Such a structure was shaped over ~500 million years by Darwinian processes of mutation and selection. During this time an arms race occurred: on the one hand the plants, which have in the cell wall a source of energy and carbon, and on the other the herbivores and pathogens. Commelinid, a group of angiosperms that includes grasses (Poaceae), has a typical cell wall, called the type II cell wall, which differs from other plant groups (non-commelinid). One of the main distinctive features of type II cell wall is the presence of high concentrations of ferulic acid in primary walls. This phenylpropanoid appears esterified to arabinoxylans, the most abundant hemicellulose in the commelinids. Like monolignols, ferulic acid can also polymerize, interconnecting arabinoxylans with each other and anchoring lignin (in secondary cell walls). The crosslinking of arabinoxylans promoted by ferulic acid is involved in the cessation of cell growth and defense against pathogen attack by reducing the access of cellulolytic enzymes to cell wall polysaccharides. Together with lignin, excess ferulic acid reduces the nutritional power of fodder and crops destined to produce second generation biofuels, on the other hand, as it is not essential for plant growth, the reduction in structural ferulic acid content does not affect productivity. Preliminary laboratory-scale experiments have shown that the application of enzyme inhibitors involved in the synthesis of ferulic acid can reduce it content in the cell wall making it easier to digest. A better use of lignocellulosic biomass can even reduce the environmental impacts caused by the agriculture and livestock production. OBJECTIVES – This study aims to: 1) evaluate the saccharification of lignocellulosic biomass of maize plants in laboratory, and field-scale after treatment with phenylpropanoid inhibitors; 2) evaluate the enzymatic digestion of the lignocellulosic biomass of brachiaria grass in agronomical-scale after treatment with phenylpropanoid pathway inhibitors (MDCA, PIP e DZN); 3) develop an efficient and economical method for the removal of soluble sugars in biomass for digestibility assays. METHODS – For laboratory tests, maize seeds (Zea mays cv. IPR-114) were sowrn in plastic pots (400 mL) containing a mixture (1:1) of vermiculite/organic substrate and grown for 15 days in a growing room under 12 hours of light/dark photoperiod with constant temperature (25 °C ± 4). The plants were watered every two days with Hoagland nutrient solution and at 7th day, with nutrient solution plus inhibitors (MDCA, PIP e DZN). For the leaf spray experiments, at the 7th day of cultivation, the plants were sprayed with solution containing the specific inhibitor plus adjuvant (Aureo®) at 0.5%. At the 15th day, the plants were harvested and a biometric analysis was performed. The material was weighed and dried at 60 °C for drying to constant weight. After complete drying, all samples were ground in a ball mill and reserved for digestibility analyzes. Field trials with maize (Z. mays) were conducted at the Iguatemi experimental farm (FEI-UEM). In two adjacent areas, applications were made by foliar spraying at two different times: at 30 and 60 days after sowing. The same inhibitors, concentration and volume of those applied in the brachiaria were used. Each trial was performed with a number of 5 replicates where each plot (n) consisted of an area of 3 m2, separated by 1 m of border area. The harvesting was performed at 120 days after germination (DAG). Once again, the plants were oven dried at 60 °C. After complete drying, all samples were ground in a ball mill and reserved for digestibility analyzes. For two distinct field experiments, we used brachiaria grass (Brachiaria decumbens) in an area of the Irrigation Training Center (CTI) of the University of Maringá (UEM) where it was already planted. For the first test, the area was mowed, followed by cleaning and after 10 days, irrigation system was applied in a single dose of the inhibitors: (PIP) 0.5 and 1.0 ?mol L-1 and (MDCA) 350 and 700 ?mol L-1. After 30 days of treatment, 1 m2 of each plot was collected and biometric analyzes were performed. The material was weighed and dried at 60 °C for drying to constant weight. In the second test, the application was done 7 days after mowing followed by cleaning the area. The inhibitors were applied by foliar spraying as follows: daidzin (0.5 and 1.0 mmol L-1), PIP (1.0 and 2.0 ?mol L-1) and MDCA (1.0 and 2.0 mmol L-1). After 30 days of treatment, 1 m2 of each plot was collected by cutting each plant close to the soil. With the fresh plants, the biometric analyzes were done. The material was weighed and dried at 60 °C for drying to constant weight. After complete drying, all the samples are crushed in ball mill and reserved for analysis of digestibility, lignin content, ferulic acid, coumaric acid and monomers. The biomasses of brachiaria grass, maize and sugarcane (Saccharum sp.) were exhaustively washed with ethanol by two methods: the first consists of incubating the biomass in ethanol at 80 °C in a test tube for 2 h, with periodic shaking, at the end this, the supernatant is discarded, and the procedure repeated until complete elimination of soluble sugars. The second consists of a reflux system based on the soxhlet method, which washes multiple samples at the same time without the need for shaking or ethanol exchange by the operator. RESULTS AND DISCUSSION – Daidzin is a competitive inhibitor of the enzyme coniferaldehyde dehydrogenase responsible for the oxidize coniferaldehyde to ferulic acid. However, its addition to the nutrient medium in vivo did not affected the digestibility of maize. An analysis of the nutrient medium revealed that glycosidases secreted by maize roots degraded daidzin to its aglycone form (daidzein), canceling out its inhibitory activity. The application of glycosidase inhibitors prevented their degradation and promoted the digestibility of maize shoot. The application of daidzin by leaf spray did not promote the digestibility of the plants in laboratory scale. The PIP and the MDCA, in turn, promoted increases of up to 23% in saccharification of the aerial part of the corn when applied by foliar sprinkling on a bench scale. Agricultural scale tests showed that the application of the inhibitors by foliar spraying promoted the digestibility of the plants harvested at the silage point (120 days). Plants treated with MDCA and PIP 30 DAG had their digestibility increased by up to 54%. On the other hand, treatments with daidzin (0.5 and 1.0 mmol L-1) increased the digestibility of maize up to 87%. The treatment of brachiaria grass with inhibitors with a single dose applied by fertigation was able to significantly increase biomass digestibility by 28% (PIP 1.0 ?mol L-1). The treatments promoted trends of increase in biomass, leaf expansion, chlorophyll content and productivity and a significant reduction in ferulic acid content, which may have contributed to leaf expansion due to its role in controlling cell growth. The leaf sprinkling assays showed an increase in digestibility with 4 h of incubation of up to 18% in the treatments with MDCA and PIP in the lowest concentrations and 15% in the PIP in the highest concentration. After 24 h of digestion MDCA treatment increased saccharification by 21%, while PIP increased saccharification by 16%, both at the lowest concentrations tested. The method of soluble solids extraction by solvent reflux reduced the time to remove sugars (when compared with the traditional method) from 18 h to 7 h or less depending on material. Due to the automated process, without the intervention of the operator, the method drastically reduced the operating time (weighing, shaking, handling of liquids). The technique also reduced ethanol consumption by 77% and electricity consumption by at least 95% (considering the sugarcane samples, which is richer in soluble solids). CONCLUSION – Foliar spraying of the three inhibitors tested was effective in promoting the digestibility of the lignocellulosic biomass of maize and brachiaria grass. Biometric data revealed a consistent trend of increase productivity due to inhibitors application. The treatments had later effects, both in maize and brachiaria grass. This suggests that the effect promoted by the treatments increases with the normal decrease in the digestibility with the plants age. In none of the treatments the lignin content has been altered and, in general, the effects on productivity are innocuous or beneficial. The reflux washing system allowed the extraction of soluble sugars in several samples in parallel, substantially reducing consumption of solvent, energy and operating time, when compared to the traditional method