Formulações responsivas ao ambiente contendo óleo resina de Copaifera reticulata Duche no combate à leishmaniose cutânea vísceral : indução da resposta imune TH1 e perfil de segurança

Abstract

RESUMO: As leishmanioses representam um desafio global em saúde pública devido à falta de avanços significativos no desenvolvimento de novas terapias desde a introdução dos antimoniais pentavalentes na década de 1940. Diante da limitada eficácia terapêutica e da alta toxicidade dos medicamentos disponíveis, a investigação de novas substâncias, baseada em conhecimentos empíricos e no uso tradicional de plantas medicinais, tem se mostrado uma alternativa promissora. Dentre as espécies vegetais de interesse, as pertencentes ao gênero Copaifera se destacam, sendo o óleo resina extraído dessas plantas um recurso natural de grande importância na medicina tradicional da região Amazônica, com atividade antileishmania promissora. No entanto, para garantir a qualidade, segurança e a eficácia dos fitoterápicos, é fundamental realizar o controle de qualidade desses produtos, desde a identificação da espécie vegetal até a presença dos agentes bioativos na formulação final, assim como garantir a sua biodisponibilidade. Além disso, o desenvolvimento de formulações farmacêuticas requer várias etapas para garantir a estabilidade do medicamento, a preservação da atividade das substâncias e a melhoria da solubilidade e biodistribuição. Nesse contexto, com base no uso tradicional do óleo de copaíba (OC) e nas evidências de sua segurança, o presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia terapêutica de um sistema auto emulsionante (F14) para administração oral e de um sistema bioadesivo termoresponsivo (F12) tópico para o tratamento da leishmaniose cutânea e visceral. Foram conduzidos estudos in vivo utilizando camundongos infectados ou não com Leishmania amazonensis ou L. infantum, nos quais foram administrados o óleo resina de C. reticulata Ducke isolado ou incorporado nas formulações F14 e F12. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados por meio de medidas de peso corporal e dos órgãos, determinação do volume das lesões e carga parasitária utilizando técnicas de bioluminescência e qPCR, avaliação dos níveis de citocinas e produção de oxido nítrico, além de análises bioquímicas e hematológicas para detectar possíveis efeitos tóxicos. Os resultados indicaram que os animais não infectados submetidos aos tratamentos com o OC e as formulações não apresentaram alterações significativas no peso corporal nem nos pesos dos órgãos, sugerindo a ausência de toxicidade dessas terapias. No entanto, nos animais infectados com L. infantum, observou-se uma redução significativa no peso corporal quando tratados com a formulação F14 com OC ou miltefosina, apesar de não apresentarem diferenças na aparência física. Essa diminuição no peso corporal foi acompanhada por uma redução no peso do fígado em todos os grupos de tratamento em comparação com o grupo controle, indicando uma possível reversão da hepatomegalia, uma característica da leishmaniose visceral, como resultado dos tratamentos administrados. Essas reduções nos pesos dos órgãos alvo foram então atribuídas à diminuição da carga parasitária confirmada por técnicas de qPCR, demonstrando a eficácia das intervenções terapêuticas. No modelo experimental de infecção com L. amazonensis, não foram observadas variações significativas no peso corporal ou nos órgãos após a necropsia. Ao avaliar o aumento no volume das lesões nas patas desses camundongos após 28 dias de tratamento, constatou-se uma redução de 64,25% e 45,42% para a formulação F14 com OC e a formulação F12 com OC, respectivamente, em comparação com o grupo controle. Esses resultados foram corroborados pelas medidas de bioluminescência e qPCR, que indicaram que a redução no volume das lesões foi diretamente proporcional a redução na carga parasitária. A ação imunomoduladora do OC e das formulações também foi avaliado, sendo observado uma polarização da resposta Th1 com aumentos nos níveis de IL-2, TNF-? e IFN-? concomitante com a redução de IL-10 e TGF-?, que como consequência levaram a aumentos de oxido nítrico e morte dos parasitos. Além da eficácia terapêutica, a segurança do uso das formulações F14 e F12 com OC foi avaliada, e os resultados indicam que essas formulações não causaram toxicidade significativa nos animais, uma vez que os marcadores renais e hepáticos apresentaram valores semelhantes aos observados nos animais não tratados. Apesar dos estudos toxicológicos publicados demonstrarem que o óleo resina de Copaifera spp. não possui efeitos mutagênico, genotóxico ou citotóxicos, e os polímeros e emulsionantes utilizados no desenvolvimento das formulações F14 e F12 serem reconhecidos como seguros e aprovados para uso em formulações farmacêuticas, ainda eram necessários estudos de toxicidade de ambas as formulações. Uma vez que a identificação de qualquer atividade toxicológica em substâncias bioativas de plantas por meio de testes pré-clínicos deve preceder seu uso em estratégias de saúde preventiva. Sendo assim, a toxicidade aguda das formulações foi avaliada em ratos Wistar machos e fêmeas ao longo de um período de 14 dias. Os ratos receberam uma dose única da formulação F14 com OC por via oral ou intraperitoneal ou da formulação F12 com OC por via tópica, na dose de 2.000 mg/kg. Avaliamos a toxicidade comportamental, bem como as alterações bioquímicas e hematológicas, incluindo toxicidades em múltiplos órgãos. A administração das formulações não resultou em mortalidade dos ratos, e nenhum efeito toxicológico foi observado em relação ao peso corporal, consumo de ração e água, peso dos órgãos ou parâmetros hematológicos e bioquímicos. Complementarmente, camundongos Swiss foram tratados com as formulações na dose de 2.000 mg/kg por 24 h e, então, realizada a coleta de medula óssea para realizar o teste de micronúcleos para avaliar potencial atividade genotóxica das formulações, a qual não foi evidenciada. Em conclusão, neste trabalho, descrevemos a eficácia terapêutica e segurança do uso das formulações F14 e F12 contendo óleo resina de C. reticulata Ducke como alternativa terapêutica para o tratamento da leishmaniose cutânea e visceral. Com estas abordagens pretende-se obter os dados necessários para notificação de novo produto fitoterápico de acordo com o estipulado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Food and Drug Administration (FDA - Estados Unidos da América) e demais agências reguladoras como uma alternativa de baixo custo para o tratamento de leishmanioses

ABSTRACT: Leishmaniasis presents a global public health challenge due to the lack of significant advancements in developing new therapies since the introduction of pentavalent antimonials in the 1940s. Given the limited therapeutic efficacy and high toxicity of available medications, investigating new substances based on empirical knowledge and the traditional use of medicinal plants has emerged as a promising alternative. Among the plant species of interest, those belonging to the genus Copaifera are notable. The oil-resin extracted from these plants is a natural resource of great importance in traditional medicine in the Amazon region, exhibiting promising anti-leishmanial activity. However, to ensure the quality, safety, and efficacy of phytotherapeutics, it is essential to conduct quality control of these products, from the identification of the plant species to the presence of bioactive agents in the final formulation, as well as to guarantee their bioavailability. Additionally, developing pharmaceutical formulations requires several steps to ensure the drug's stability, preservation of the active substances' activity, and improvement of solubility and biodistribution. In this context, based on the traditional use of copaiba oil (CO) and evidence of its safety, this study aimed to evaluate the therapeutic efficacy of a self-emulsifying system (F14) for oral administration and a topical thermoresponsive bioadhesive system (F12) for treating cutaneous and visceral leishmaniasis. In vivo studies were conducted using mice infected or not with Leishmania amazonensis or L. infantum, where C. reticulata Ducke oil-resin was administered either in isolation or incorporated into the F14 and F12 formulations. The treatment effects were evaluated by measuring body and organ weights, determining lesion volume and parasitic load using bioluminescence and qPCR techniques, assessing cytokine levels and nitric oxide production, and conducting biochemical and hematological analyses to detect potential toxic effects. The results indicated that uninfected animals subjected to CO and formulation treatments did not exhibit significant changes in body weight or organ weights, suggesting the absence of toxicity of these therapies. However, in animals infected with L. infantum, a significant reduction in body weight was observed when treated with the F14 formulation with CO or miltefosine, despite no differences in physical appearance. This decrease in body weight was accompanied by a reduction in liver weight in all treatment groups compared to the control group, indicating a possible reversal of hepatomegaly, a characteristic of visceral leishmaniasis, as a result of the administered treatments. These reductions in target organ weights were attributed to the decreased parasitic load confirmed by qPCR techniques, demonstrating the efficacy of the therapeutic interventions. In the experimental infection model with L. amazonensis, no significant variations in body or organ weights were observed after necropsy. When evaluating the increase in lesion volume on the paws of these mice after 28 days of treatment, reductions of 64.25% and 45.42% were observed for the F14 formulation with CO and the F12 formulation with CO, respectively, compared to the control group. These findings were corroborated by bioluminescence and qPCR measurements, which indicated that the reduction in lesion volume was directly proportional to the reduction in parasitic load. The immunomodulatory action of CO and the formulations was also evaluated, revealing a Th1 response polarization with increased levels of IL-2, TNF-?, and IFN-?, concomitant with reduced levels of IL-10 and TGF-?, leading to increased nitric oxide production and parasite death. Besides therapeutic efficacy, the safety of using the F14 and F12 formulations with CO was evaluated, and the results indicate that these formulations did not cause significant toxicity in the animals, as renal and hepatic markers showed values similar to those observed in untreated animals. Despite published toxicological studies demonstrating that Copaifera spp. oil-resin does not possess mutagenic, genotoxic, or cytotoxic effects, and the polymers and emulsifiers used in developing the F14 and F12 formulations are recognized as safe and approved for use in pharmaceutical formulations, toxicity studies of both formulations were still necessary. Identifying any toxicological activity in bioactive plant substances through preclinical tests must precede their use in preventive health strategies. Thus, the acute toxicity of the formulations was evaluated in male and female Wistar rats over 14 days. The rats received a single dose of the F14 formulation with CO orally or intraperitoneally or the F12 formulation with CO topically at a dose of 2,000 mg/kg. We assessed behavioral toxicity and biochemical and hematological changes, including multi-organ toxicities. The administration of the formulations did not result in rat mortality, and no toxicological effects were observed regarding body weight, food and water consumption, organ weights, or hematological and biochemical parameters. Additionally, Swiss mice were treated with the formulations at a dose of 2,000 mg/kg for 24 h, and bone marrow was collected for micronucleus testing to assess potential genotoxic activity of the formulations, which was not evidenced. In conclusion, this work describes the therapeutic efficacy and safety of the F14 and F12 formulations containing C. reticulata Ducke oil-resin as an alternative therapy for cutaneous and visceral leishmaniasis. These approaches aim to obtain the necessary data for the notification of a new phytotherapeutic product in accordance with the regulations of the National Health Surveillance Agency (ANVISA), the Food and Drug Administration (FDA - United States of America), and other regulatory agencies as a low-cost alternative for leishmaniasis treatment