Análise da citogenotoxicidade do bio-óleo proveniente da biomassa de eucalipto (eucalyptus spp.) em células de allium cepa L. E de astyanax lacustris

Abstract

Resumo: O eucalipto é uma espécie arbórea, pertencente à família Myrtaceae, gênero Eucalyptus cujas características e propriedades físico-químicas têm sido muito utilizadas para a recuperação e preservação de áreas degradadas, na indústria de papel e celulose, e como matéria-prima para a produção de bio-óleo através da pirólise lenta. O bio-óleo de eucalipto possui diversas aplicações como, por exemplo, uma alternativa como biocombustíveis, na produção de bio-asfaltos, na substituição de biomassa para produção de hidrogênio, produção de materiais semelhantes a grafite e até mesmo na produção de diferentes plásticos. Contudo, de acordo com suas diversas aplicações e utilização crescente nos últimos anos, o que pode resultar em sua disseminação nos diferentes ecossistemas, sua toxicidade necessita ser avaliada. Portanto, o presente estudo tem como objetivo avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade do bio-óleo de eucalipto (Eucalyptus spp.) em modelo vegetal, Allium cepa L.(cebola) e animal utilizando uma espécie de peixe, Astyanax lacustris, in vivo. Para a análise de citotoxicidade em Allium cepa L. foram avaliados o crescimento radicular, avaliação do índice mitótico (IM) e aberrações cromossômicas (AC), incluindo micronúcleos e fragmentos cromossômicos. Ambos modelos bioindicadores foram submetidos às concentrações de bio-óleos de eucalipto em, 0,190; 0,375; 0,750; 1,570; 3,130 e 6,250%, por 72 horas para A.cepa L. e 7 dias para espécimes de A. lacustris. Adicionalmente, um bio-óleo de uva foi testado no modelo Allium cepa L. Ambos bio-óleos foram solubilizados em Tween 80 a 80%. Para análise de citotogenoxicidade em A. lacustris 40 peixes, divididos em 8 grupos contendo 5 animais por grupo. Após exposição, o sangue foi extraído a partir da nadadeira caudal e realizado esfregaço em lâmina de vidro para as avaliações de citogenotoxicidade pelos testes do micronúcleo, ensaio do cometa e análise de alterações morfológicas dos eritrócitos. Além disso, uma análise bioquímica foi realizada para quantificação das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) em todos os grupos de peixes, utilizando métodos cinéticos e kits comerciais para quantificação. Os dados foram analisados quanto à normalidade e submetidos aos testes Kruskal-Wallis, ANOVA e pós-testes de Tukey e Bonferroni, com um nível de significância de 5%. Em A. cepa L., os resultados demonstraram que o grupo de raízes expostas ao Tween 80 a 8% e controle (somente água) não afetou o crescimento radicular e do índice mitótico (IM). As concentrações de 0,375%, 0,750% e 1,570% dos bio-óleos (BO) de eucalipto e uva inibiram o crescimento radicular em comparação ao controle negativo e o emoliente (Tween 80), evidenciando citotoxicidade. A concentração de 0,190% do BO de eucalipto também inibiu o crescimento radicular, enquanto o BO de uva mostrou crescimento discreto das raízes. O IM foi afetado em concentrações onde o crescimento radicular foi inibido, sugerindo que o BO pode interromper o ciclo celular. Este resultado sugere que as células das raízes de cebola terminaram seu ciclo não havendo continuidade no ciclo celular de novas células, o que pode indicar uma parada no ciclo celular devido a danos às proteínas reguladoras ou ao DNA. Eritrócitos de A. lacustris expostos a concentrações elevadas (1,570%) apresentaram núcleos fragmentados, com diferenças estatisticamente significativas em relação ao controle, sugerindo estresse celular ou apoptose. A presença de micronúcleos em todos os grupos (1-13), sendo maior na concentração de 0,375%, indicaram instabilidade cromossômica. O ensaio do cometa demonstrou que o BO causou danos ao DNA em todas as concentrações testadas, com um padrão de alterações que se correlaciona com a concentração do bio-óleo. As concentrações maiores do bio-óleo de eucalipto mostraram danos dose-dependente. Na análise bioquímica ocorreu um aumento significativo nas atividades das enzimas AST e ALT em todas as concentrações de BO, com o maior aumento registrado na concentração de 0,750%. Esses resultados sugerem estresse hepático e alterações na integridade da membrana celular, além disso, os dados obtidos demonstraram que, mesmo sendo um composto biológico, os bio-óleos merecem devida atenção quando eventualmente, sejam disseminados no ambiente podendo afetar negativamente os organismos.

Abstract: Eucalyptus is a tree species, belonging to the Myrtaceae family, genus Eucalyptus, whose characteristics and physical-chemical properties have been widely used for the recovery and preservation of degraded areas, in the paper and cellulose industry, and as raw material for the production of bio-oil through slow pyrolysis. Eucalyptus bio-oil has several applications, for example, as an alternative as biofuels, in the production of bio-asphalt, in replacing biomass for hydrogen production, production of materials similar to graphite and even in the production of different plastics. However, according to its diverse applications and increasing use in recent years, which may result in its dissemination in different ecosystems, its toxicity needs to be evaluated. Therefore, the present study aims to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of eucalyptus bio-oil (Eucalyptus spp.) in a plant model, Allium cepa L. (onion) and an animal model using a species of fish, Astyanax lacustris, in vivo. For the analysis of cytotoxicity in Allium cepa L., root growth, assessment of the mitotic index (MI) and chromosomal aberrations (AC), including micronuclei and chromosomal fragments, were evaluated. Both bioindicator models were subjected to concentrations of eucalyptus bio-oils at 0.190; 0.375; 0.750; 1,570; 3.130 and 6.250%, for 72 hours for A.cepa L. and 7 days for A. lacustris specimens. Additionally, a grape BO wastested in the Allium cepa L. model. Both bio-oils were solubilized in 80% Tween 80. For cytotogenoxicity analysis in A. lacustris 35 fish, divided into 7 groups containing 5 animals per group. After exposure, blood was extracted from the caudal fin and smeared on a glass slide for cytogenotoxicity assessments using the micronucleus test, comet assay and analysis of morphological changes in erythrocytes. Furthermore, a biochemical analysis was performed to quantify the enzymes aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in all groups of fish, using kinetic methods and commercial kits for quantification. The data were analyzed for normality and subjected to the Kruskal-Wallis, ANOVA and Tukey and Bonferroni post-tests, with a significance level of 5%. In A. cepa L., the results demonstrated that the group of roots exposed to 8% Tween 80 and control (water only) did not affect root growth and mitotic index (MI). Concentrations of 0.375%, 0.750% and 1.570% of eucalyptus and grape bio-oils (BO) inhibited root growth compared to the negative control and the emollient (Tween 80), showing cytotoxicity. The concentration of 0.190% of eucalyptus BO also inhibited root growth, while grape BO showed discrete root growth. IM was affected at concentrations where root growth was inhibited, suggesting that BO may arrest the cell cycle. This result suggests that the onion root cells have finished their cycle and there is no continuity in the cell cycle of new cells, which may indicate an arrest in the cell cycle due to damage to regulatory proteins or DNA. A. lacustris erythrocytes exposed to high concentrations (1.570%) showed fragmented nuclei, with statistically significant differences in relation to the control, suggesting cellular stress or apoptosis. The presence of micronuclei in all groups (1-13), being higher at a concentration of 0.375%, indicated chromosomal instability. The comet assay demonstrated that BO caused DNA damage at all concentrations tested, with a pattern of alterations that correlates with the bio-oil concentration. Higher concentrations of eucalyptus bio-oil showed dose-dependent damage. In the biochemical analysis, there was a significant increase in the activities of the AST and ALT enzymes at all concentrations of BO, with the greatest increase recorded at the concentration of 0.750%. These results suggest hepatic stress and changes in the integrity of the cell membrane. Furthermore, the data obtained demonstrated that, even though they are a biological compound, bio-oils deserve due attention when eventually disseminated in the environment and, may negatively affect organisms.