A infecção viral por BmNPV altera o padrão de expressão teci-dual do gene BmsbRNA em Bombyx mori

Abstract

Resumo: A ordem Lepidóptera possui cerca de 500 mil espécies, representadas pelas borboletas e mariposas, as quais podem atuar como pragas de culturas vegetais, como é o caso da broca-dacana; no envolvimento com a manutenção da biodiversidade (cadeia alimentar e polinização de várias angiospermas); além de algumas espécies estarem envolvidas com processos antropológicos e econômicos. Este é o caso do bicho-da-seda (Bombyx mori), inseto que produz casulos de seda que são utilizados historicamente na confecção de tecidos, cordas e outros produtos à base de seda, constituindo um mercado muito valorizado no mundo inteiro desde a antiguidade. A sericicultura compreende o processo de criação e beneficiamento dos fios de seda, e constitui uma área de grande importância sócio-cultural no Brasil, já que é uma atividade realizada primordialmente em pequenas propriedades agrícolas, sendo de extrema importância para o provimento de sustento para milhares de famílias do sul e sudeste do país. Além do aspecto de produção, B. mori é um organismo modelo muito utilizado tanto em pesquisas científicas de base, como em áreas avançadas da tecnologia. Pode-se citar o uso deste organismo na área da biotecnologia, como biorreator para a produção de moléculas de interesse, o uso da seda para a construção de biopolímeros, empregados na criação de biomateriais, como por exemplo próteses médicas, na pesquisa de base nas áreas da biologia celular, bioquímica, bioengenharia, virologia, dentre outros. Assim como todo processo de produção agricola e animal, a criação do bicho-da-seda é influenciada por diversos fatores abióticos - como e temperatura, umidade, manejo - e bióticos como a genética dos híbridos comerciais, a qualidade das amoreiras, e a sanidade animal. A interferência por patógenos é um problema grave que afeta a sanidade animal do bicho-da-seda, sabendo que esta espécie são muito sensíveis à variações ambientais e ação de patógenos, principalmente devido ao baixo fitness populacional ocasionado pelo proceso de seleção artificial contínuo e criação em condições controladas por milhares de anos. Dentre os agentes patogênicos, microrganismos como bactérias e fungos, além de vírus, são muito comuns no processo de criação. Os vírus, especialmente o baculovírus Bombyx morinucleopolyhedrovirus (BmNPV), são piores causadores de prejuízos econômicos dentre os tipos de patógenos, compreendendo cerca de 70% das perdas de produção. O baculovíus BmNPV é o agente da doença denominada "amarelidão" - o principal problema de sanidade da sericicultura da atualidade -, que leva à morte, a um rápido contágio da criação e, consequentemente, em perdas na produtividade de casulos. Este vírus infecta as lagartas de B. mori via oral e se espalha sistematicamente a partir das células do epitélio intestinal, resultando nos efeitos patológicos da doença. No campo da biologia molecular, muitos estudos têm sido realizados visando entender os mecanismos moleculares empregados pelo BmNPV para o processo de infecção e o estabelecimento da patologia. Por outro lado, diversos estudos visam obter o mesmo entendimento acerca das respostas do hospedeiro no combate e controle da infecção viral. Estes estudos frequentemente têm conduzidos experimentos que visam identificar as variações no quadro de transcritos (isto é, diminuição, aumento ou desligamento da expressão) provocadas pela infecção viral e/ou pela resposta imunológica. Os non-coding RNAs (ncRNAs, RNA não codificantes) têm sido atrelados a uma grande variedade de funções moleculares imprescindíveis aos processos biológicos, como na estruturação da cromatina, maturação do RNA mensageiro, regulação e modulação da expressão gênica, nos processos de replicação do DNA, bem como em condições patológicas. Desta forma, verifica-se que o produto da expressão gênica está muito além da síntese de polipeptídeos, mas constitui-se como um processo que produz também uma grande diversidade de RNA funcionais, dos quais algumas das principais classes são os miRNAs (microRNAs), lnRNAs (longRNAs), circRNAs (ncRNAs circulares), snRNAs (pequenos ncRNAs nucleares), dentre outros. Muitos destes ncRNAs são encontrados ligados em proteínas, sendo essenciais na formação de complexos moleculares funcionais, outros tem como mecanismo de ação o pareamento com mRNAs, como no caso dos RNA de interferência, que controlam a expressão gênica de forma pós transcricional, enquanto que por outro lado, alguns apresentam interação direta com o DNA ou cromatina. Dentre os RNAs funcionais, destacam-se os Y RNAs, que constituem uma importante classe de ncRNA expressos em mamíferos. Em humanos apresentam expressão de quatro genes: hY1, hY3, hY4 e hY5. Os Y RNAs foram encontrados em complexos ribonucleoproteicos (RNPs) associados a proteína Ro60 e La, e desde então tem contribuído principalmente para a elucidação de processos relacionados a replicação cromossomal e para o desenvolvimento de marcadores moleculares para diversos cânceres. Em invertebrados, foi descrita uma classe de ncRNAs homólogos aos Y RNAs, os quais foram primeiramente descritos no nematóide Caenorhabditis elegans, e posteriormente verificado expresso em Bombyx mori (BmsbRNA) e Drosophila melanogaster (Dm1e Dm2). Estes ncRNAs são denominados Stem-bulge RNAs (sbRNAs), e sua homologia com os Y RNAs é verificada tanto em estrutura, como também em funcionalidade. Ambos possuem um padrão estrutural do tipo haste-loop, sequencias evolutivamente conservadas, e motivos relacionados à sua atuação funcional essencial no processo de licenciamento da replicação do DNA, progressão do ciclo celular, apoptose e resposta ao estresse celular. Resultados preliminares mostrando expressão tecido-específica do gene BmsbRNA e aparente supressão em corpo gorduroso de larvas de B. mori infectadas por BmNPV, tornou premente a caracterização precisa do padrão de expressão deste gene e o teste destas condições em relação à infecção pelo vírus BmNPV. Neste projeto foi realizada a quantificação relativa por RT-qPCR do gene BmsbRNA em diferentes tecidos larvais de B. mori afim de confirmar os indícios de expressão. Os resultados mostraram que, juntamente com o marcador de proliferação celular (PCNA), o gene BmsbRNA foi superexpresso em tecidos gonadais testículo e ovário em relação aos outros tecidos analisados. Ainda, foi possível demonstrar que nestes tecidos o genealvo teve um aumento constante de expressão ao longo do final do estágio larval. Finalmente, experimentos de infecção viral por BmNPV foram conduzidos em lagartas de B. mori a fim de verificar se a infecção viral modula o nível de expressão do gene BmsbRNA em diferentes tempos da infecção. Com isso, foi possível confirmar que a infecção viral reduz significativamente os níveis de BmsbRNA em testíclos, ovários e corpo gorduroso. Outrossim, ficou demonstrado que em hemolinfa e túbulos de Malpighi, a infecção viral promoveu um padrão diferente de modulação, com aumento progressivo em túbulos de Malpighi e aumento seguido de redução em hemolinfa. Os resultados aqui obtidos evidenciam que o gene BmsbRNA deva exercer função no contexto fisiológico dos tecidos, especialmente em processos que envolvem a replicação do DNA e nas relações patógeno-hospedeiro no âmbito da infecção por BmNPV.

Abstract: The Lepidoptera order has around 500,000 species, represented by butterflies and moths, which can act as pests of plant crops, as is the case with the sugarcane borer; they are involved in maintaining biodiversity (food chain and pollination of various angiosperms); and some species are involved in anthropological and economic processes. This is the case of the silkworm (Bombyx mori), an insect that produces silk cocoons that have historically been used to make fabrics, ropes and other silk-based products, and has been a highly valued market worldwide since ancient times. Sericulture comprises the process of creating and processing silk threads, and is an area of great socio-cultural importance in Brazil, since it is an activity carried out primarily on small farms, and is extremely important for providing a livelihood for thousands of families in the south and southeast of the country. In addition to the production aspect, B. mori is a model organism that is widely used both in basic scientific research and in advanced areas of technology. These include the use of this organism in the field of biotechnology, as a bioreactor for the production of molecules of interest, the use of silk for the construction of biopolymers, used in the creation of biomaterials, such as medical prostheses, in basic research in the fields of cell biology, biochemistry, bioengineering, virology, among others. As with all agricultural and animal production processes, silkworm rearing is influenced by various abiotic factors - such as temperature, humidity, management - and biotic factors such as the genetics of the commercial hybrids, the quality of the mulberry trees, and animal health. Interference by pathogens is a serious problem that affects the animal health of silkworms, knowing that this species is very sensitive to environmental variations and the action of pathogens, mainly due to the low population fitness caused by the process of continuous artificial selection and rearing under controlled conditions for thousands of years. Among the pathogens, microorganisms such as bacteria and fungi, as well as viruses, are very common in the breeding process. Viruses, especially the baculovirus Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), are the worst cause of economic damage among the types of pathogens, accounting for around 70% of production losses. The baculovirus BmNPV is the agent of the disease called grasserie - the main health problem in sericulture today - which leads to death, rapid contamination of the brood and, consequently, losses in cocoon productivity. This virus infects B. mori caterpillars orally and spreads systematically from the cells of the intestinal epithelium, resulting in the pathological effects of the disease. In the field of molecular biology, many studies have been carried out to understand the molecular mechanisms employed by the BmNPV in the infection process and the establishment of pathology. On the other hand, several studies aim to obtain the same understanding of the host's responses to fighting and controlling the viral infection. These studies have often conducted experiments aimed at identifying variations in the transcriptome (i.e. a decrease, increase or switch-off in expression) caused by viral infection and/or the immune response. Non-coding RNAs (ncRNAs) have been linked to a wide variety of molecular functions that are essential to biological processes, such as structuring chromatin, maturing Messenger RNA, regulating and modulating gene expression, DNA replication processes and pathological conditions. Thus, the product of gene expression goes far beyond the synthesis of polypeptides, but is also a process that produces a great diversity of functional RNA, some of the main classes of which are miRNAs (microRNAs), lnRNAs (longRNAs), circRNAs (circular ncRNAs), snRNAs (small nuclear ncRNAs), among others. Many of these ncRNAs are found bound to proteins and are essential in the formation of functional molecular complexes, others have the mechanism of action of pairing with mRNAs, as in the case of interference RNA, which control gene expression in a post-transcriptional way, while on the other hand, some have a direct interaction with DNA or chromatin. Among the functional RNAs, the Y RNAs stand out as an important class of ncRNA expressed in mammals. In humans, they are expressed in four genes: hY1, hY3, hY4 and hY5. Y RNAs were found in ribonucleoprotein complexes (RNPs) associated with the Ro60 and La proteins, and have since contributed mainly to the elucidation of processes related to chromosomal replication and to the development of molecular markers for various cancers. In invertebrates, a class of ncRNAs homologous to Y RNAs has been described, which were first described in the nematode Caenorhabditis elegans, and later found to be expressed in Bombyx mori (BmsbRNA) and Drosophila melanogaster (Dm1 and Dm2). These ncRNAs are called Stem-bulge RNAs (sbRNAs), and their homology with Y RNAs is verified both in structure and functionality. Both have a stem-loop structural pattern, evolutionarily conserved sequences, and motifs related to their essential functional role in the process of licensing DNA replication, cell cycle progression, apoptosis and response to cellular stress. Preliminary results showing tissue-specific expression of the BmsbRNA gene and apparent suppression in the fat body of B. mori larvae infected with BmNPV, made it urgent to characterize the precise expression pattern of this gene and to test these conditions in relation to infection by the BmNPV virus. In this project, the relative quantification by RT-qPCR of the BmsbRNA gene in different B. mori larval tissues was carried out in order to confirm the evidence of expression. The results showed that, together with the cell proliferation marker (PCNA), the BmsbRNA gene was overexpressed in testis and ovary gonadal tissues compared to the other tissues analyzed. It was also possible to demonstrate that in these tissues the target gene had a constant increase in expression throughout the end of the larval stage. Finally, BmNPV viral infection experiments were carried out on B. mori caterpillars in order to check whether viral infection modulates the expression level of the BmsbRNA gene at different times during infection. This confirmed that viral infection significantly reduces BmsbRNA levels in the testis, ovary and fat body. Furthermore, it was shown that in hemolymph and Malpighian tubules, viral infection promoted a different pattern of modulation, with a progressive increase in Malpighian tubules and an increase followed by a reduction in hemolymph. The results obtained here show that the BmsbRNA gene must play a role in the physiological context of tissues, especially in processes involving DNA replication and in pathogen-host relationships in the context of BmNPV infection.