Efeito das mutações pontuais G54C e H250R sobre a atividade enzimática da Glutamina

Abstract

Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio capaz de se associar a Poaceae de interesse econômico, como arroz, milho e cana-de-açúcar. O nitrogênio fixado pode ser disponibilizado para a planta hospedeira, o que contribui para o crescimento vegetal. No entanto, a fixação biológica de nitrogênio (N) é extremamente regulada em Pseudomonadota. Por isso, há uma busca constante por bactérias fixadoras de N que possuam genes mutantes específicos em seus genomas, que permitam maiores níveis de fixação e assimilação de N. Algumas dessas mutações foram encontradas nas vias de assimilação de NH4 +. Um desses genes é o gene glnA, codificante da enzima Glutamina sintetase (GS), que está envolvida na assimilação de NH4 + na forma de glutamina. A atividade biológica da GS pode ser regulada por modificação pós-traducional covalente: adenililação ou desadenilalação reversível. Tendo isso em vista, esse trabalho teve como objetivo estudar o efeito das mutações pontuais sítio-dirigidas G54C e H250R na regulação do estado de modificação pós-traducional das variantes mutantes recombinantes G54C e H250R da GS de H. seropedicae. Os genes glnA mutantes que codificam essas proteínas mutantes foram clonados no vetor de expressão pETNdeM-11. As proteínas mutantes recombinantes foram superexpressas em Escherichia coli BL 21 (DE3) com diferentes níveis de nitrogênio, e purificadas por romatografia de afinidade. O estado de modificação pós-traducional das variantes mutantes de GS foi avaliado tanto diretamente por Western blot utilizando o anticorpo primário anti-AMP, quanto indiretamente, pela inibição do íon Magnésio (Mg2+) em reações ?-glutamilhidroxamato (?-GT). Com isso, como resultados, observamos que a enzima mutante H25OR parece não ser adenililada durante sua produção em células de E. coli nas mesmas condições em que a GlnE de E. coli adenilila a GS selvagem e, que a variante truncada GlnE 3-6 e a enzima bifuncional GlnE de H. seropedicae parecem ter dificuldade de adenililar a H250R. Ao contrário, a variante mutante G54C pode ser adenililada pela GlnE de E. coli e pela GlnE 3-6 e GlnE nas mesmas condições em que a GS selvagem é adenililada.

Abstract: Herbaspirillum seropedicae, is a nitrogen-fixing bacteria, capable of colonizing Poaceae of economic interest, such as rice, corn and sugarcane. Fixed nitrogen can be provided to the host plant, which contributes to plant growth. However, biological nitrogen (N) fixation is highly regulated in Pseudomonadota. For this reason, there is a constant search for N-fixing bacteria that have specific mutant genes in their genomes, which allow higher levels of N fixation and assimilation. Some of these mutations have been found in the NH+ 4 assimilation pathways. One of these genes is the glnA gene, which encodes the enzyme Glutamine synthetase (GS), that is involved in the assimilation of NH+ 4 in the form of glutamine. The biological activity of GS can be regulated by covalent post-translational modification: reversible adenylylation or deadenylation. Therefore, this work aimed to study the effect of site-directed point mutations G54C and H250R on the regulation of post-translational modification state of recombinant mutant variants G54C and H250R of H. seropedicae. The mutant glnA genes encoding these mutant proteins were cloned into the expression vector pETNdeM-11. The recombinant mutant proteins were overexpressed in Escherichia coli BL 21 (DE3) with different nitrogen levels, and purified by affinity chromatography. The post-translational modification status of the GS mutant variants was evaluated both directly by Western blot using the anti-AMP primary antibody, and indirectly, by the inhibition of Magnesium ion (Mg2+) in ?-glutamylhydroxamate (?-GT) reactions. Thus, as a result, we observed that the H25OR mutant enzyme does not seems to be adenylylated during its production in E. coli cells under the same conditions in which E. coli GlnE adenylylates wild-type GS, and that the truncated variant GlnE 3-6 and the bifunctional enzyme GlnE from H. seropedicae seem to have difficulty adenylylating H250R. On the contrary, the G54C mutant variant can be adenylylated by GlnE of E. coli and by GlnE 3-6 and GlnE under the same conditions in which wild-type GS is adenylylated.