Efeitos Toxicológicos da Metformina em Astyanax lacustris : uma abordagem Morfológica, Hematológica, Reprodutiva e Histológica

Abstract

RESUMO: A contaminação do meio aquático por produtos farmacêuticos é uma realidade mundial, causando grande preocupação, tanto ambiental, quanto para a saúde humana. A metformina, importante medicamento antidiabético utilizado mundialmente, não somente para tratamento da diabetes, mas de outras doenças tem sido detectada em diversos corpos d'água, com concentrações variáveis em escalas de ng L?¹ ou ?g L?¹. No entanto, estudos com organismos aquáticos não alvos, incluindo espécies de peixes têm demonstrado os efeitos adversos da metformina, quando presente no meio aquático. Portanto, para garantir a saúde dos ecossistemas aquáticos e identificar espécies em risco devido aos efeitos nocivos dos contaminantes ambientais, é crucial integrar análises que utilizem diversos biomarcadores. Espécies de peixes que possuem ampla distribuição geográfica como Astyanax lacustris têm sido considerados potenciais bioindicadores de impactos ambientais e são usados como modelos experimentais em estudos toxicológicos devido à sua sensibilidade a vários tipos de contaminantes, incluindo produtos farmacêuticos. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade da metformina em espécimes adultos de Astyanax lacustris (lambaris), os quais foram submetidos a tratamentos crônicos de exposição a soluções de metformina nas concentrações de 50 ?g/L, 100 ?g/L e 10.000 ?g/L durante 90 dias. Após o período de experimentação, utilizando diferentes tipos de biomarcadores foi possível avaliar o potencial citotóxico e genotóxico deste fármaco por meio de análise das alterações morfológicas em eritrócitos, danos ao DNA (teste do Cometa), viabilidade celular por citometria de fluxo e os efeitos histopatológicos sobre as brânquias dos peixes. Além disso, em uma outra abordagem e, considerando evidências de que a metformina atua como desregulador endócrino, avaliamos também a gametogênese dos animais através da histologia das gônadas, imunohistoquímica do fígado utilizando o anticorpo antivitelogenina, e análise da condensação da cromatina (utilizando a técnica de CEC, Concentração Crítica de Eletrólitos), correlacionando esses testes para uma a avaliação dos potenciais perigos representados pela metformina quando introduzida no ambiente aquático. Como resultados identificamos diferentes tipos de anormalidades nos eritrócitos, que afetaram a integridade das células, visíveis através de alterações em sua morfologia, sugerindo possíveis rupturas de membrana, presença de vacúolos citoplasmáticos, alterações nucleares, danos ao DNA e até mesmo anomalias indicativas de processo de divisão amitótica. A citometria de fluxo revelou aumento de células inviáveis, com efeito dose- dependente da metformina. Importantes alterações histológicas foram evidenciadas nas brânquias como, fusão de lamelas secundárias, hiperplasia, telangiectasia, hemorragia e vacuolização. Na análise histológica das gônadas foram observados oócitos nas gônadas masculinos dos indivíduos tratados com metformina nas concentrações de 100?g/L (com sinais parciais de intersexo) 10.000?g cujas análises indicaram intersexo. Este resultado juntamente com a evidências de produção de vitelogenina no tecido hepático também sugeriram desregulação endócrina. Além dos efeitos da metformina em diferentes níveis (tecidos, células e de DNA) nos espécimes de A. lacustris, sob o ponto de vista morfológico foram analisados os índices gonadosomáticos (IGS) e um caráter sexual secundário que consiste em espículas presentes na nadadeira anal de indivíduos machos que confere uma textura áspera ao toque durante o período reprodutivo. Quanto ao IGS houve uma redução significativa nos peixes tratados com a maior concentração (10.000 ?g/L) de metformina em relação controle. Com 6 relação a presença das espículas observamos que nos três tratamentos e grupo controle, em três indivíduos após exposição a concentração de 100 ?g/L e em quatro indivíduos da concentração de 10.000 ?g/L, a nadadeira anal não exibiu tais espículas, indicando a possível perda de sua característica sexual secundária. Este conjunto de dados demonstraram os efeitos significativamente adversos da metformina em todas as concentrações avaliadas, ainda que em baixas concentrações no ambiente. Essas descobertas destacam a importância de políticas de monitoramento e controle de fármacos em ecossistemas aquáticos, visando proteger a biodiversidade e a saúde dos organismos aquáticos, bem como garantir a segurança da água para consumo humano

ABSTRACT: Contamination of the aquatic environment by pharmaceutical products is a global reality, causing great concern, both environmentally and for human health. Metformin, an important antidiabetic drug used worldwide, not only to treat diabetes, but also other diseases, has been detected in several bodies of water, with concentrations varying on scales of ng L?¹ or ?g L?¹. However, studies with non-target aquatic organisms, including fish species, have demonstrated the adverse effects of metformin when present in the aquatic environment. Therefore, to ensure the health of aquatic ecosystems and identify species at risk due to the harmful effects of environmental contaminants, it is crucial to integrate analyzes that use diverse biomarkers. Fish species that have a wide geographic distribution, such as Astyanax lacustris, have been considered potential bioindicators of environmental impacts and are used as experimental models in toxicological studies due to their sensitivity to various types of contaminants, including pharmaceutical products. Thus, the present study aimed to evaluate the toxicity of metformin in adult specimens of Astyanax lacustris (lambaris), which were subjected to chronic exposure treatments to metformin solutions at concentrations of 50 ?g/L, 100 ?g/L and 10,000 ?g/L for 90 days. After the experimental period, using different types of biomarkers, it was possible to evaluate the cytotoxic and genotoxic potential of this drug through analysis of morphological changes in erythrocytes, DNA damage (Comet test), cell viability by flow cytometry and histopathological effects. on the gills of fish. Furthermore, in another approach, considering evidence that metformin acts as an endocrine disruptor, we also evaluated the gametogenesis of animals through gonad histology, immunohistochemistry of the liver using the antivitellogenin antibody, and analysis of chromatin condensation (using the technique CEC, Critical Electrolyte Concentration), correlating these tests to assess the potential dangers represented by metformin when introduced into the aquatic environment. As a result, we identified different types of abnormalities in erythrocytes, which affected the integrity of the cells, visible through changes in their morphology, suggesting possible membrane ruptures, the presence of cytoplasmic vacuoles, nuclear changes, DNA damage and even anomalies indicative of the process of amitotic division. Flow cytometry revealed an increase in non-viable cells, with a dose- dependent effect of metformin. Important histological changes were evident in the gills, such as fusion of secondary lamellae, hyperplasia, telangiectasia, hemorrhage and vacuolization. In the histological analysis of the gonads, oocytes were observed in the male gonads of individuals treated with metformin at concentrations of 100?g/L (with partial signs of intersex) and 10,000?g whose analyzes indicated intersex. This result, together with evidence of vitellogenin production in liver tissue, also suggested endocrine disruption. In addition to the effects of metformin at different levels (tissues, cells and DNA) in specimens of A. lacustris, from a morphological point of view, gonadosomatic indices (IGS) and a secondary sexual character consisting of spicules present on the anal fin were analyzed of male individuals that gives a rough texture to the touch during the reproductive period. Regarding IGS, there was a significant reduction in fish treated with the highest concentration (10,000 ?g/L) of metformin compared to control. Regarding the presence of spikes, we observed that in the three treatments and control group, in three individuals after exposure to a concentration of 100 ?g/L and in four individuals at a concentration of 10,000 ?g/L, the anal fin did not exhibit such spikes, indicating the possible loss of their secondary sexual characteristic. This set of data demonstrated the significantly adverse effects of metformin at all concentrations evaluated, even at low concentrations in the environment. These findings highlight the importance of policies for monitoring and controlling pharmaceuticals in aquatic ecosystems, aiming to protect biodiversity and the health of aquatic organisms, as well as ensuring the safety of water for human consumption