Protocolo de purificação da enzima enteroquinase na forma ativa

Abstract

Resumo: A Enteroquinase, ou EK, é uma enzima de alto valor comercial, aproximadamente U$ 6,00 aunidade, e seu uso é de extrema importância na pesquisa científica, por ser responsável pela remoção de caudas N-terminais e ativação de proteínas recombinantes. Esse fato torna a EK uma enzima de extrema importância para a biotecnologia, visto que uma pequena quantidade dessa enzima é suficiente para preparação de grandes quantidades de outras enzimas recombinantes. A purificação da EK recombinante não é trivial, já que é uma proteína bastante insolúvel e expressa em corpos de inclusão. Neste presente trabalho, desenvolvemos um protocolo para expressão de EK recombinante, purificação da proteína desnaturada e posterior renaturação in vitro. Para testar a atividade da EK purificada dessa forma, utilizamos a Fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) fusionada a cauda His contendo sítio de clivagem reconhecido por EK. A PEPC é uma enzima característica de plantas C4, como o milho, as quais são mais produtivas que as demais plantas C3, devido a um aumento da atividade de outra enzima, a Rubisco, reduzindo assim a fotorrespiração, responsável por causar perdas na eficiência fotossintética e consequentemente, melhor aproveitamento de água e nitrogênio. Portanto, por meio do consumo de NADH pela PEPC ativa, conseguimos confirmar a atividade catalítica da EK purificada e renaturada através do novo protocolo elaborado pelo nosso grupo de forma mais simples e menos custosa, facilitando a obtenção desta enzima.

Abstract: Enterokinase, or EK, is an enzyme with high commercial value, approximately U$ 6.00 perunit, and its use is extremely important in scientific research, as it is responsible for the removal of N-terminal tails and activation of recombinant proteins. This fact makes EK anextremely important enzyme for biotechnology, since a small amount of this enzyme is sufficient for the preparation of high amounts of other recombinant enzymes. The purification of recombinant EK is not trivial, since it is a very insoluble protein and expressed in inclusion bodies. In this work, we developed a protocol for the expression of recombinant EK, purification of the denatured protein and subsequent in vitro renaturation. To test the activity of EK purified in this way, we used phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) fused to a His-tag containing a cleavage site recognized by EK. PEPC is an enzyme characteristic of C4 plants, such as corn, which are more productive than other C3 plants, due to an increase in the activity of another enzyme, Rubisco, thus reducing photorespiration, which is responsible for causing losses in photosynthetic efficiency and, consequently, better use of water and nitrogen. Therefore, through the consumption of NADH by active PEPC, we were able to confirm the catalytic activity of purified and renatured EK through the new protocol developed by our group in a simpler and less costly way, facilitating the obtaining of this enzyme.