Restrição do teor de proteina materna durante a amamentação altera o desenvolvimento ontogenético, o metabolismo intermediário, modificando o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal a partir da peripuberdade a vida adulta

Abstract

Resumo: O período pós-natal é um momento vulnerável para o desenvolvimento ontogenético, durante o qual os neonatos passam da dependência placentária para a alimentação por meio do leite materno que fornece nutrientes essenciais para o crescimento e maturação dos órgãos. A desnutrição materna, particularmente durante a lactação, tem o potencial de alterar o fenótipo da prole, resultando em mudanças notáveis durante a peripuberdade, fase de maturação sexual que diferencia os sexos biológicos. Além disso, essa fase é considerada a última janela de vulnerabilidade a insultos metabólicos, especialmente no hipotálamo, que atua como ponte entre os sistemas nervoso e endócrino (neuroendócrino) e é suscetível à programação materna. Este estudo elucida o impacto da restrição proteica materna durante os dois terços iniciais da lactação em descendentes com fenótipo magro, com ênfase especial na regulação de genes envolvidos no eixo hipotálamo-hipófise-testicular (HPT), esteroidogênese, espermatogênese, metabolismo intermediário, padrões de metilação hipotalâmica, metabolismo hepático, capacidade pr-oxidante e antioxidantes durante a peripuberdade até a vida adulta. Materiais e métodos: O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes ARRIVE e recebeu aprovação ética do Comitê de Ética (protocolo 8620070222/2022). Foram utilizados ratos Wistar machos e fêmeas, com idades de 80 e 70 dias, respectivamente. Após o acasalamento, as fêmeas prenhes foram aleatoriamente distribuídas em dois grupos alimentares: o grupo controle (NP), que recebeu uma dieta normal de proteínas (23%), e o grupo de baixa proteína (LP), que recebeu uma dieta com 4% de proteínas durante os primeiros 14 dias de lactação, seguida por uma dieta normal na última semana. A prole foi desmamada no dia pós-natal (PND) 21 e monitorada até o PND90, com medidas de peso corporal e marcadores metabólicos em intervalos (PN14, PN35, PN45, PN55 e PN90). Foram realizadas análises biométricas e bioquímicas, incluindo avaliações do tempo de puberdade, peso na puberdade, testes de tolerância à glicose e sensibilidade à insulina. As concentrações séricas de hormônios relacionados ao equilíbrio energético e à função reprodutiva, incluindo insulina, testosterona e corticosterona, foram mensuradas. O eixo hipotálamo-hipófise-testicular (HPT) foi investigado por meio da expressão de peptídeos estimuladores e inibidores do gene Gnrh1 e genes relacionados à função testicular, incluindo aqueles envolvidos na biossíntese de esteroides e espermatogênese. Amostras de hipotálamo foram utilizadas para avaliar o mRNA das metilases de DNA (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b) envolvidas na programação epigenética materna na lactação. Resultados e discussão: A restrição proteica materna durante a lactação resultou em atraso no tempo de puberdade e na redução do peso da prole no início da puberdade. A regulação do eixo HPT foi alterada, com aumento da kisspeptina (mRNA de Kiss1) no dia pós-natal (PND) 45. No entanto, a transcrição do hormônio liberador de gonadotrofina 1 (Gnrh1) permaneceu inalterada, indicando que, embora o eixo tenha sido modulado, ele continuou funcional. A atividade da aromatase foi aumentada no PN 35 e diminuida no PN 45 do periodo peripuberal, resultando em na queda da testosterona no PN 45. Observou-se comprometimento da espermatogênese, acompanhado por diminuições na expressão de genes envolvidos nesse processo, incluindo receptor do hormônio Fshr , Kit (espermatogônias diferenciadas), Rhcg (espermatócitos) e Lrrc34 (espermátides) na peripuberdade. Além disso, genes associados às células de Sertoli, como Lgals1, também foi menor no PN 35 e maior no PN 55, indicando que a desnutrição materna pode comprometer o ambiente intratesticular, afetando tanto a síntese de esteroides quanto a diferenciação das células espermáticas. A dieta LP retardou o ganho de massa corporal, o ganho de peso dos estoques de tecido adiposo e causou hipometilação nas DNA durante o PN 35 e o PN55 da peripuberdade. A sensibilidade à insulina é maior a partir do PN 45, acompanhada de alterações no metabolismo de lipídios, proteico e glicidico durante a peripuberdade. Embora o conteúdo de lipídios hepáticos estivesse elevado durante a infância pelo metodo FOLCH, retornou a níveis normais a partir da peripuberdade até a vida adulta. A elevação de lipeperoxidação lipidica, proteinas carboniladas que são marcadores de injúrias hepáticas indicou a presença de estresse oxidativo na prole LP na peripuberdade, embora haja aumento da enzima catalase em todas as idades na peripuberdade, isso sugere um aumento da capacidade antioxidante.Conclusão: A restrição de proteínas durante a amamentação promove retardo no crescimento corporal, atrasa o tempo de puberdade, modifica o metabolismo intermediário e hepático, induz programação epigenética hipotalâmica, prejudicando o funcionamento do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, que modula a regulação de Gnrh1, genes chaves na biossíntese de esteroides sexuais e a expressão de genes espermatogênicos em descendentes machos com fenótipo subpesado ao longo da vida.

Abstract: The postnatal period is a critical window of ontogenetic development during which neonates transition from placental dependence to maternal milk feeding, which provides essential nutrients for organ growth and maturation. Maternal malnutrition, particularly during lactation, can alter the phenotype of the offspring, leading to marked changes during peripuberty, a phase of sexual maturation that distinguishes the biological sexes. Furthermore, this phase is considered the last window of vulnerability to metabolic insults, especially in the hypothalamus, which acts as a bridge between the nervous and endocrine (neuroendocrine) systems and is highly susceptible to maternal programming. This study will elucidate the effects of maternal protein restriction during the first two-thirds of lactation on offspring with a lean phenotype, with a particular focus on gene regulation within the hypothalamic-pituitary-testicular (HPT) axis, steroidogenesis, spermatogenesis, intermediary metabolism, hypothalamic methylation patterns, hepatic metabolism, and oxidative and antioxidant capacity from peripubertal to adulthood. Materials and methods: This study followed the ARRIVE guidelines and received ethical approval from the Ethics Committee (protocol 8620070222/2022). Male and female Wistar rats of 80 and 70 days of age, respectively, were used. After mating, pregnant females were randomly assigned to two dietary groups: the control group (NP), which received a normal protein diet (20.5%), and the low protein group (LP), which received a 4% protein diet for the first 14 days of lactation followed by a normal diet for the last week. The offspring were weaned on postnatal day (PND) 21 and monitored until PND90 (infancy, peripuberty, and young adulthood), with body weight and metabolic markers measured at intervals (PND14, PND35, PND45, PND55 and PND90). Biometric and biochemical analyses were performed, including assessments of pubertal onset, body weight at puberty, glucose tolerance tests, and insulin sensitivity. Serum concentrations of hormones related to energy balance and reproductive function, including insulin, testosterone and corticosterone, were measured. The HPT axis was assessed by the expression of stimulatory and inhibitory peptides for the Gnrh1 gene and genes related to testicular function, including those involved in steroid biosynthesis and spermatogenesis. Hypothalamic samples were used to assess mRNA expression of DNA methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b) involved in maternal epigenetic programming during lactation. Results and discussion: Maternal protein restriction during lactation delayed pubertal timing and reduced offspring body weight at pubertal onset. Regulation of the HPT axis was altered, with an increase in kisspeptin (Kiss1 mRNA) expression at postnatal day (PND) 45. However, transcription of gonadotropin-releasing hormone 1 (Gnrh1) remained unchanged, indicating that the axis was modulated but remained functional. Aromatase activity increased at PND35 but decreased at PND45, resulting in a decrease in testosterone at PND45. Spermatogenesis was impaired, as evidenced by reduced expression of genes involved in this process, including Fshr (hormone receptor), Kit (differentiated spermatogonia), Rhcg (spermatocytes) and Lrrc34 (spermatids) during peripuberty. In addition, Sertoli cell-related genes such as Lgals1 showed lower expression at PND35 and higher expression at PND55, suggesting that maternal malnutrition may disrupt the intratesticular environment, affecting both steroid synthesis and sperm cell differentiation. The LP diet slowed body mass gain, reduced adipose tissue accumulation and caused DNA hypomethylation at PND35 and PND55 of peripuberty. Insulin sensitivity was higher from PND45, accompanied by changes in lipid, protein and carbohydrate metabolism during peripuberty. Although hepatic lipid content was elevated in early life according to the Folch method, it returned to normal levels from peripuberty to adulthood. Increased markers of liver injury, including lipid peroxidation and protein carbonylation, were indicative of oxidative stress in LP offspring during peripuberty, although catalase enzyme levels were elevated at all ages during peripuberty, suggesting enhanced antioxidant capacity. Conclusion: Protein restriction during lactation delays body growth, shifts pubertal timing, alters intermediary and hepatic metabolism, and induces hypothalamic epigenetic programming that impairs hypothalamic-pituitary-gonadal axis function, which regulates Gnrh1, key steroidogenic genes, and spermatogenic gene expression throughout the lifespan in male offspring with a low weight phenotype.