Aspectos morfológicos de Candida albicans durante o processo de candidíase sistêmica seriada e descrição de proteínas potencialmente associadas a virulência

Abstract

RESUMO: Candidaalbicans expressa fatores de virulência que auxiliam no desenvolvimento da infecção. Nesse sentido, em estudos anteriores, nosso grupo de pesquisa utilizou o modelo murino de candidíase sistêmica, em infecções seriadas, para entender melhor a adaptação patógeno-hospedeiro. Nós observamos um aumento do perfil de virulência de C. albicans recuperadas ao longo das passagens. Além disso, nosso estudo proteômico revelou a presença de várias proteínas relacionados aos fatores de virulência e proteínas ainda não caracterizadas. Também, por meio desse modelo, nós detectamos que C. albicans produziu algumas colônias com morfologia diferenciada, aliado à presença de proteínas relacionadas ao switching fenotípico. Assim, nosso objetivo, primeiramente foi estudar a morfologia das colônias obtidas após cada passagem e entender se há correlação com aspectos de virulência. Nós detectamos dois tipos de colônias com diferenças na filamentação periférica. O morfotipo 1 (zero a cinco filamentos ao redor da colônia) foi mais prevalente em P2, já o morfotipo 2 (mais de cinco filamentos na região periférica da colônia) foi predominante de P3 em diante. Os testes de fatores de virulência mostraram que no geral, o morfotipo 1 apresentou níveis similares de filamentação, invasão e resistência às condições de estresse em todas as passagens analisadas. Já o morfotipo 2, exibiu um melhoramento nessas habilidades. Desta forma, observamos uma concordância entre o aumento dos atributos de virulência ao longo das passagens em nosso estudo anterior com o aumento do perfil de adaptabilidade do morfotipo 2. O nosso segundo objetivo foi reunir proteínas associadas à parede celular, envolvidas na filamentação, com impacto na virulência de C. albicans, uma vez que, esse é um importante fator de virulência. Nós encontramos 26 proteínas que possuem papel na virulência de C. albicans em estudos que realizaram ensaios de filamentaçãoin vitro. Proteínas como Adh1, Als1, Ecm33, Phr1, entre outras, foram importantes tanto para filamentação em meio líquido como em meio sólido. Como essas proteínas estão na face externa de C. albicans, elas podem ser bons alvos para novas terapias antifúngicas, candidatos a vacinas ou biomarcadores para diagnóstico de candidíase. Outras proteínas como Hwp1, Pga7, Plb5, Rbt1, Rhd3/Pga29 e Sap10 não foram essenciais para a filamentaçãoin vitro, mas exercem outra função como adesinas, ligantes de receptores das células, enzimas, que também têm influência na virulência dessa levedura. Por fim, nosso último objetivo foi investigar se a proteína não caracterizada Orf19.36.1, que tinha sido detectada em maior abundância em nosso estudo proteômico anterior após candidíase sistêmica seriada, estaria envolvida na patogenicidade e virulência de C. albicans. Para isso, construímos cepas mutantes homozigotas no gene ORF19.36.1 utilizando a estratégia de CRISPR/Cas9 (Conjunto de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Espaçadas em associação com a nuclease Cas9). Nós comparamos o comportamento da cepa mutante homozigota com a cepa parental em diversos ensaios fenotípicos e de virulência. Nós observamos que ambas as cepas apresentaram perfis similares de crescimento, filamentação, invasão, adesão, atividade hidrolítica, formação de biofilme e de resistência às condições de estresse. Além disso, a deleção desse genenão diminuiu a virulência de C. albicans em dois modelos experimentais. Portanto, a Orf19.36.1, isoladamente, parece não ter um papel essencial na patogênese e virulência de C. albicans.

ABSTRACT: Candida albicans expresses virulence factors that aid in the development of infection. In this way, in previous studies, our research group used the murine model of systemic candidiasis, in serial infections, to better understand the host-pathogen adaptation. We observed an increase in the virulence profile of C. albicans recovered over the passages. Furthermore, our proteomics study revealed the presence of several proteins related to virulence factors and proteins not yet characterized. Also, through this model, we detected that C. albicansproduced some colonies with differentiated morphology, together with the presence of proteins related to phenotypic switching. Thus, our objective was firstly to study the morphology of the colonies obtained after each passage and understand if there is a correlation with virulence aspects. We detected two types of colonies with differences in the peripheral filamentation. The morphotype 1 (zero to five filaments around the colony) was more prevalent in P2, while morphotype 2 (more than five filaments in the peripheral region of the colony) was predominant from P3 onwards. The assays in the virulence factors showed that, in general, morphotype 1 showed similar levels of filamentation, invasion and resistance to stress conditions in all passages analyzed. The morphotype 2, on the other hand, exhibited an enhancement in these abilities. In this way, we observed a concordance between the increase in the virulence attributes along the passages in our previous study with the increase in the adaptability profile of morphotype 2. Our second objective was to gather cell wall-associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of C. albicans, since this is an important virulence factor. We found 26 proteins that play a role in C. albicans virulence in studies that performed in vitrofilamentation assays. Proteins such as Adh1, Als1, Ecm33, Phr1, among others, were important for both filamentation in liquid and solid media. As these proteins are on the outer face of C. albicans, they can be good targets for t new antifungal therapies, vaccine candidates or biomarkers for the diagnosis of candidiasis. Other proteins such as Hwp1, Pga7, Plb5, Rbt1, Rhd3/Pga29 and Sap10 were not essential for in vitrofilamentation, but they play another function as adhesins, cell receptor ligands, enzymes, which also have an influence on the virulence of this yeast. Finally, our last objective was to investigate whether the uncharacterized protein Orf19.36.1, which had been detected in greater abundance in our previous proteomic study after serial systemic candidiasis, would be involved in the pathogenicity and virulence of C. albicans. For this, we constructed homozygous mutant strains in the ORF19.36.1 gene using the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR associated protein 9) strategy. We compared the behavior of the homozygous mutant strain with the parental strain in several phenotypic and virulence assays. We observed that both strains showed similar profiles of growth, filamentation, invasion, adhesion, hydrolytic activity, biofilm formation and resistance to stress conditions. Furthermore, the deletion of this gene did not decrease the virulence of C. albicans in two experimental models. Therefore, Orf19.36.1 alone does not seem to play an essential role in the pathogenesis and virulence of C. albicans.