Desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos transdérmicos, termorresponsivos e fototerapêuticos, com propriedades bactericida, leishmanicida e cicatrizante

Abstract

RESUMO: A presente tese de doutorado está estruturada em dez capítulos, compostos pelos artigos que trazem a investigação realizada ao longo do curso. A primeira parte da tese é constituída por cinco artigos, os quais abordam o desenvolvimento de formulações (emulgéis) obtidas à base dos polímeros F127, carbopol e óleo de copaíba C. reticulata Ducke. A segunda parte, por sua vez, contém cinco artigos. Nestes, o trabalho propõe o uso da Terapia Fotodinâmica nas formulações à base de óleo de copaíba através da incorporação de clorofilas provenientes do extrato de espinafre ou Spirulina sp. O Capítulo 1 é composto pelo manuscrito intitulado "Design and optimization of stimuli-responsive emulsion-filled gel for topical delivery of copaiba oil-resin", publicado na Journal of Pharmaceutical Sciences (DOI 10.1016/j.xphs.2021.10.003). Os estudos nele contidos demonstram o planejamento quimiométrico inicial, onde as concentrações de F127, óleo de copaíba e carbopol são variadas. Seu objetivo foi identificar a tendência do comportamento reológico das formulações ao variar o conteúdo polimérico em situações em que o teor do óleo se encontra próximo do limite de incorporação. O Capítulo 2 é composto pelo artigo "Thermal stimuli-responsive topical platform based on copaiba oil-resin: Design and performance upon ex-vivo human skin", publicado na Journal of Molecular Liquids (DOI 10.1016/j.molliq.2022.119625). O manuscrito supracitado contempla o segundo planejamento quimiométrico, com modelagem matemática e avaliação de superfície de resposta. Neste, concentrações de F127 e óleo de copaíba foram variadas, onde os valores selecionados foram amparados nos resultados preliminares dispostos no Capítulo 1. O trabalho apresenta estudos reológicos, mecânicos, bioadesão e permeação em pele humana, além da validação do medicamento por métodos cromatográficos e ensaios de atividade antiproliferativa para a forma promastigota de L. amazonensis e L. infantum. Deste estudo selecionaram-se três formulações cujas propriedades mecânicas e reológicas foram mais atrativas para aplicações dermatológicas. O Capítulo 3 apresenta aplicações in vitro para os três medicamentos otimizados (descritos no capítulo anterior) e para o óleo resina puro. Esta parte da tese descreve estudos para a forma amastigota de L. amazonensis e L. infantum, forma esta prevalente no homem e principal alvo das terapias. Os experimentos resultaram no Short communication intitulado "Thermoresponsive leishmanicidal emulgel based on Copaifera reticulata Ducke: in vitro studies with the amastigote forms", atualmente submetido em periódico. O Capítulo 4 constitui um artigo completo, nomeado "Design and Optimization of a Natural Medicine from Copaifera reticulata Ducke for Skin Wound Care", publicado na revista Polymers (MDPI) (DOI 10.3390/polym14214483). Estes estudos demonstraram a obtenção de novas formulações otimizadas, projetadas principalmente para a clínica veterinária, compostas por menores concentrações de polímeros e maiores teores de óleo de copaíba. Neste manuscrito, estudos in vitro foram conduzidos, constatando potencial bactericida. Ainda, bezerros e novilhas com feridas agravadas por miíases receberam o medicamento uma vez ao dia, realçando o potencial cicatrizante, repelente, larvicida e bactericida da formulação. Um segundo grupo de animais foi tratado com óleo resina de copaíba (sem formular), o qual também resultou em notáveis efeitos de cicatrização e cura. O Capítulo 5, por sua vez, é composto pelo manuscrito "Design of an emulgel based on copaiba oil-resin as a natural chemotherapeutic agent for the treatment of bovine mastitis", atualmente submetido em periódico Qualis A. Neste, a mesma formulação, qualificada no Capítulo 5, foi utilizada em um novo estudo in vivo, realizado com vistas à prevenir a mastite em vacas leiteiras com histórico de células somáticas elevadas no leite (mastite crônica). Mesmo diante do histórico clínico dos animais, a formulação foi capaz de prevenir o quadro infeccioso, mantendo a contagem de células somáticas no leite equivalente ao controle utilizado. A segunda parte desta tese, também composta por cinco artigos, surgiu do propósito de aumentar o espectro antimicrobiano das formulações. Para isso, os emulgéis receberam fotossensibilizadores naturais (clorofilas) para que, mediante a aplicação da Terapia Fotodinâmica, a carga de micro-organismos fosse reduzida sem ocasionar efeitos de resistência bacteriana. O Capítulo 6 contempla estudos de obtenção de extratos, trazendo à tona a sustentabilidade como alternativa para a indústria farmacêutica. Nesse processo, Extrações com Líquido Pressurizado (ELP) permitiram obter extratos com maior qualidade (concentrados de clorofilas) e quantidade, sem gerar resíduos tóxicos ao meio ambiente e ao homem. Os experimentos foram publicados na Journal of Supercritical Fluids como artigo completo, intitulado "Obtaining phytotherapeutic chlorophyll extracts using pressurized liquid technology" (DOI 10.1016/j.supflu.2021.105457). A qualificação do potencial fotodinâmico do extrato, obtido pela metodologia ELP, foi realizada no Capítulo 7. Neste, ensaios in vitro com a bactéria S. aureus foram realizados e monitorados por técnicas espectroscópicas de varredura e transmissão. Os resultados compõem o manuscrito nomeado "Photodamage on Staphylococcus aureus by natural extract from Tetragonia tetragonoides (Pall.) Kuntze: clean method of extraction, characterization and photophysical studies", publicado na Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology (DOI 10.1016/j.jphotobiol.2019.111763). O conjunto de resultados indicaram, de forma contundente, benefícios/potencial do extrato obtido pela metodologia ELP na terapia dermatológica. O Capítulo 8 apresenta um trabalho completo, disponibilizado como artigo vulgarizado na sessão Ecoando da Revista Bioika (online) ISSN 2619-3191. O trabalho de vulgarização científica foi intitulado "ELP: Uma metodologia ecologicamente correta para obtenção de fármacos naturais" e descreve, com linguagem popular, os benefícios da extração por líquido pressurizado ao meio ambiente, bem como as vantagens do produto obtido à saúde do homem. O Capítulo 9 teve como elemento propulsor: o trabalho anteriormente foi publicado, que revelou F?1O2 equivalente para o extrato de espinafre e a clorofila a (pura); a elevada efetividade do extrato frente à bactéria S. aureus (verificado no Capítulo 7); e, as propriedades leishmanicidas e cicatrizantes do óleo de copaíba (evidenciados entre os Capítulos 2 e 5). Assim, o Capítulo 9 visa compor uma alternativa terapêutica capaz de reunir todos os benefícios supraditos em um único produto. O trabalho compõe o artigo intitulado "Thermo and photoresponsive emulgel loaded Copaifera reticulata Ducke and Chlorophylls: rheological, mechanical, photodynamic and drug delivery in human skin", atualmente aceito na revista Pharmaceutics. Este, contempla o desenvolvimento de formulações compostas por óleo de copaíba (na concentração otimizada, Capítulo 2) e extrato rico em clorofilas (extrato ELP, nas concentrações de 0,5 e 1,0 % m/m). Os resultados demonstraram propriedades bioadesivas e sugeriram potencial transdérmico, ao avaliar a permeação em pele humana. Ainda, a mistura apresentou propriedades antimicrobianas, constituindo em uma alternativa terapêutica promissora. Por fim, os benefícios da combinação do óleo de copaíba com clorofilas, mediada pela TFD, levou à obtenção de novos medicamentos também projetados para aplicação dermatológica, em que todos os constituintes majoritários do formulado dispõem de atividade terapêutica. Assim, o Capítulo 10 apresenta formulações compostas por carragena-kappa (polímero antimicrobiano e cicatrizante), óleo de copaíba (C. reticulata) e espirulina (como fonte de clorofilas), com vistas a atuar como antimicrobiano, cicatrizante e leishmanicida. Como teste de eficácia, estudos in vivo foram conduzidos no tratamento de pododermatite (lesões de grau III e IV) em coelhos. Nesse processo, foi empregado sistema de iluminação projetado para a referida aplicação, mantendo uma dimensão suficiente para iluminar toda a extensão da pata do animal, mesmo diante do deslocamento dos coelhos nas gaiolas. Os resultados manifestaram, de forma incisiva, os benefícios da combinação terapêutica e a consolidação de que os produtos descritos no Capítulo 10 são promissores para a clínica humana e veterinária. O conteúdo encontra-se disponível no artigo intitulado "Photo-phytotherapeutic gel composed of Copaifera reticulata, chlorophylls, and k-carrageenan: a new perspective for topical healing", publicado na Pharmaceutics (MDPI) (https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14122580).

ABSTRACT: This doctoral thesis is organized into ten chapters, each comprising a scientific article that documents the research conducted throughout the program. The first part includes five articles focused on the development of emulgel formulations based on the polymers F127, carbopol, and Copaifera reticulata Ducke (copaiba) oil. The second part features five additional articles exploring the use of Photodynamic Therapy (PDT) in these formulations through the incorporation of chlorophylls derived from spinach extract or Spirulina sp. Chapter 1 presents the article "Design and optimization of stimuli-responsive emulsion-filled gel for topical delivery of copaiba oil-resin", published in Journal of Pharmaceutical Sciences (DOI: 10.1016/j.xphs.2021.10.003). It details the initial chemometric planning where concentrations of F127, copaiba oil, and carbopol were varied to investigate the rheological behavior of the formulations near the oil incorporation threshold. Chapter 2 features the article "Thermal stimuli-responsive topical platform based on copaiba oil-resin: Design and performance upon ex-vivo human skin", published in Journal of Molecular Liquids (DOI: 10.1016/j.molliq.2022.119625). This study builds on Chapter 1, applying response surface methodology to optimize F127 and copaiba oil concentrations. It includes rheological, mechanical, bioadhesion, and human skin permeation analyses, as well as chromatographic validation and antiproliferative tests against L. amazonensis and L. infantum (promastigote forms). Three optimized formulations were selected for their dermatologically favorable properties. Chapter 3 reports in vitro applications of the three optimized formulations and the pure resin oil against the amastigote forms of L. amazonensis and L. infantum—the clinically relevant forms in humans. This work resulted in the short communication "Thermoresponsive leishmanicidal emulgel based on Copaifera reticulata Ducke: in vitro studies with the amastigote forms", currently under review. Chapter 4, published as "Design and Optimization of a Natural Medicine from Copaifera reticulata Ducke for Skin Wound Care" in Polymers (DOI: 10.3390/polym14214483), presents formulations with reduced polymer and increased oil content, tailored for veterinary use. In vitro tests confirmed bactericidal activity, and in vivo treatment of cattle with myiasis-related wounds demonstrated healing, larvicidal, repellent, and antibacterial properties. Chapter 5 describes the manuscript "Design of an emulgel based on copaiba oil-resin as a natural chemotherapeutic agent for the treatment of bovine mastitis", currently under review by a Qualis A journal. The same formulation from Chapter 4 was evaluated in vivo to prevent chronic mastitis in dairy cows. Despite the animals' clinical history, the treatment effectively maintained low somatic cell counts. The second part of the thesis aims to broaden the antimicrobial spectrum of the formulations by incorporating natural photosensitizers (chlorophylls) for PDT-based microbial load reduction without inducing bacterial resistance. Chapter 6, published as "Obtaining phytotherapeutic chlorophyll extracts using pressurized liquid technology" in Journal of Supercritical Fluids (DOI: 10.1016/j.supflu.2021.105457), discusses sustainable chlorophyll extraction via Pressurized Liquid Extraction (PLE), achieving high-quality, concentrated extracts without toxic residues. Chapter 7 evaluates the photodynamic potential of the PLE-derived extract against Staphylococcus aureus using spectroscopic techniques. Results, published in Journal of Photochemistry & Photobiology B: Biology as "Photodamage on Staphylococcus aureus by natural extract from Tetragonia tetragonoides (Pall.) Kuntze: clean method of extraction, characterization and photophysical studies" (DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2019.111763), highlight its promise in dermatological applications. Chapter 8 shares a science communication article published in the Ecoando section of Bioika Journal (ISSN 2619-3191), titled "ELP: an ecologically correct methodology for obtaining natural drugs". It presents the environmental and health benefits of the PLE process in accessible language. Chapter 9, based on the proven photodynamic efficacy of spinach extract and chlorophyll a, antimicrobial activity (Chapter 7), and the therapeutic properties of copaiba oil (Chapters 2–5), develops a comprehensive therapeutic formulation. The article "Thermo and photoresponsive emulgel loaded Copaifera reticulata Ducke and Chlorophylls: rheological, mechanical, photodynamic and drug delivery in human skin", accepted in Pharmaceutics, reports on emulgels combining optimized copaiba oil (from Chapter 2) with PLE chlorophyll extract (0.5–1.0% w/w). Results demonstrated bioadhesive and antimicrobial activity, with strong potential for transdermal delivery. Chapter 10, published as "Photo-phytotherapeutic gel composed of Copaifera reticulata, chlorophylls, and k-carrageenan: a new perspective for topical healing" in Pharmaceutics (DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14122580), presents kappa-carrageenan-based formulations enriched with copaiba oil and Spirulina-derived chlorophylls. In vivo tests treating severe pododermatitis in rabbits demonstrated notable healing, antimicrobial, and leishmanicidal efficacy, confirming the potential of these formulations for both human and veterinary applications.