Benefícios das b-glucanas para a saúde intestinal e biossíntese de b-1,3-glucanases fúngicas

Abstract

RESUMO: As ?-glucanas são polímeros de açúcar constituídos de várias unidades monossacarídicas, diferindo-se pelas ligações glicosídicas que as unem. Nas indústrias alimentícias são utilizadas como espessantes, gelificante, texturizante e estabilizantes, contudo, podem apresentar baixa solubilidade em água e elevada viscosidade, dificultando sua aplicação. Também podem ser utilizadas na saúde humana e animal quando consideradas suas propriedades bioativas. Entretanto as ?-glucanas podem apresentar baixa solubilidade em água e elevada viscosidade, dificultando sua aplicação industrial. Para solucionar esses problemas a hidrolise enzimática pode ser utilizada para auxiliar na obtenção de oligossacarídeos bioativos e proporcionar aplicações tecnológicas e biológicas. Desta forma, as ?-1,3-glucanases sintetizada por fungos filamentosos possuem amplas aplicabilidades nas indústrias alimentícia, química e farmacêutica, entretanto, sua obtenção pode ser onerosa, especialmente devido substratos utilizados para induzir sua síntese. A produção enzimática pode ser realizada com células microbianas libres ou imobilizadas. Portanto, a técnica de imobilização de microrganismos por adesão passiva em superfícies, como em esponja naturais e sintéticas, tem grande potencial para aplicação industrial e pode ser usada na produção das ?-1,3-glucanases. Este processo apresenta diversas vantagens sobre o método convencional com células livres, como a capacidade de utilizar os microrganismos em lotes repetitivos com fácil recuperação das células do meio de fermentação e redução do risco de contaminação. OBJETIVOS. O objetivo deste trabalho foi ressaltar os benefícios das ?-glucanas bioativas, e produzir ?-1,3-glucanase por T. harzianum Rifai, utilizando células livres e imobilizadas em esponjas sintética e vegetal, empregando diferentes substratos indutores que pudessem proporcionar melhor custo-benefício para a produção industrial da enzima. MATERIAL E METODOS. Foi feito um estudo de revisão sobre as ?-glucanas e seus benefícios, com o objetivo de caracterizá-las e discorrer sobre seu potencial de atuação na saúde intestinal como polímero bioativo de ação prebiótica e imunomoduladora. Juntamente, foi realizado a síntese da enzima ?-1,3-glucanase pelo fungo T. harzianum Rifai. Os substratos específicos estudados foram: curdlana, succinoglucana, amido de milho, amido de mandioca, biomassa fúngica e lactose. Os substratos foram avaliados quanto à produção de ?-glucanases na presença do fungo T. harzianum Rifai e da levedura A. pullulan 1WA1, por meio da observação de halo de hidrolise em placa de Petri (zimograma). Após triagem dos substratos pela técnica qualitativa de zimograma, foram realizados ensaios de produção enzimática. A produção de ?-1,3-glucanases foi estudada por meio do cultivo de T. harzianum Rifai utilizando células livres e imobilizadas em esponja sintética por meio de processos em lotes repetitivos. Para a imobilização microbiana foram utilizadas matrizes natural e sintética, respectivamente, bucha de Luffa cylindricae esponja sintética de poliuretano. As matrizes foram preparadas em forma de discos, cada um com aproximadamente 25 mm de diâmetro e espessura. Também foram realizados ensaios para síntese de ?-1,3-glucanases com diferentes concentrações de amido de milho e amido de mandioca (0,15%; 0,5%; 1,0%; 3,0% e 5,0%), utilizando somente células livres. A atividade da ?-1,3-glucanases foi determinada pela quantificação dos açúcares redutores liberados da hidrolise do substrato laminarina, de acordo com o método do cuproarsenato descrito por Somogyi e Nelson. A unidade de atividade de ?-1,3-glucanases foi definida como o número de ?moL de açúcares redutores liberados por minuto por mL de extrato enzimático nas condições de ensaio. Os resultados da síntese de ?-1,3-glucanases foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey, considerando o nível de significância de 5% (p ? 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO. O método de zimograma, o qual é uma técnica qualitativa, de baixo custo e rápida, se mostrou eficiente para triagem de substratos indutores de ?-glucanases frente a espécies de fungos filamentosos. Todos os substratos avaliados apresentaram resultado positivo para o método. Foi possível realizar imobilização do T. harzianum Rifai em ambas esponjas sintética e natural. Entretanto, após exposição da esponja natural (L. cylindrica) ao fungo em lotes repetitivos de produção da ?-1,3-glucanases, iniciou um processo de degradação do suporte natural, impedindo sua utilização. A degradação do suporte natural foi relacionada ao potencial de síntese de xilanase e celulase pelo T. harzianum. Quanto aos substratos testados, todos resultaram em síntese de ?-1,3-glucanase, incluindo a succinoglucana, proposto de forma inovadora neste estudo. A biomassa fúngica resultou no melhor substrato indutor em condições de células livres e imobilizadas, com uma produção de ?-1,3-glucanases de 0,73 U e 0,80 U de ?-1,3-glucanases. O bom desempenho da biomassa fúngica como substrato indutor já era esperado, uma vez que é conhecido na literatura que as espécies de Trichoderma sintetizam uma maior quantidade de ?-glucanases extracelulares quando cultivado em um meio que contenha parede celular fúngica. O amido de milho conseguiu manter a produção de ?-1,3-glucanases até o quarto lote avaliado, mostrando ser um substrato bastante interessante, visto que atualmente é o mais barato e acessível no mercado dentre os avaliados nesta pesquisa. A síntese de ?-1,3-glucanase utilizando células imobilizadas, no primeiro lote, em relação as células livres, apresentou um acréscimo na produção de ?-1,3-glucanases para os meios indutores biomassa fúngica, lactose e succinoglucana com e sem glicose, que atingiram uma concentração enzimática cerca de 8,74%, 47,80%, 78,10% e 46,90% superior, respectivamente. Os substratos amido de milho e mandioca mostraram promissores na produção de ?-1,3-glucanase. O amido de milho apresentou melhor resultado neste ensaio e, para os dois substratos estudados, ocorreu o aumento da produção enzimática frente o acréscimo da concentração até 1,0% de substrato, sendo obtido 0,51 U e 0,46 U para amido de milho e amido de mandioca, respectivamente. A partir de 3% de substrato ocorreu diminuição da produção de ?-1,3-glucanases para os dois substratos. Não foi observado diferença significativa entre o amido de milho e de mandioca quando utilizada as concentrações de 0,5% e 1% de substrato. Semelhanças na produção entre os substratos deve ser considerada um fator relevante e positivo, tendo em vista a possibilidade de substituição da matéria prima pela indústria frente a variação de preços, devido a sazonalidade das culturas agrícolas. CONCLUSÃO. É possível utilizar a técnica de zimograma para triagem de substratos indutores de ?-1,3-glucanases. A biomassa fúngica resultou em boa produção enzimática, contudo, sua aquisição é restrita. As fontes de amido se mostraram promissoras para produção enzimática pelo T. harzianum, sendo de fácil aquisição industrial e de baixo custo. A succinoglucana é passível de ser utilizada como substrato indutor na produção de ?-1,3-glucanases fúngica. O uso de células livres e imobilizadas permitiram o reaproveitamento do microrganismo, possibilitando o uso em lotes repetitivos. Portanto, o uso das ?-1,3-glucanases possibilita o melhor aproveitamento industrial das ?-glucanas com potencial bioativo.

ABSTRACT: ?-glucans are sugar polymers composed of several monosaccharide units. Differentiate by the glycosidic bonds that bind them together. In food industries, they are used as thickeners, gelling agents, texturizers, and stabilizers, however, they can have low water solubility and high viscosity, making their application difficult. They can also be used in human and animal health when considering their bioactive properties. However, ?-glucans may have low water solubility and high viscosity, making their industrial application difficult. To solve these issues enzymatic hydrolysis can be used to help obtain bioactive oligosaccharides and provide technological and biological applications. Therefore, the ?-1,3-glucanases synthesized by filamentous fungi have wide applicability in the food, chemical, and pharmaceutical industries. However, its obtainment can be costly, especially due to substrates used to induce its synthesis. Enzyme production can be carried out with free or immobilized microbial cells. Therefore, the microorganism immobilization technique by passive adhesion to surfaces, such as natural and synthetic sponges, has great potential for industrial application and can be applied in the production of ?-glucanases. This process has several advantages over the conventional method with free cells, such as the ability to use the microorganisms in repetitive batches, easy recovery of cells from the fermentation medium, and a reduction in contamination risk. OBJECTIVES. This work aimed to highlight the benefits of bioactive ?-glucans and produce ?-1,3-glucanase by T. harzianum Rifai, using free and immobilized cells in synthetic and plant sponges, using different inducing substrates that could provide better cost-effectiveness for the industrial production of the enzyme. MATERIALS AND METHODS. A review study was carried out on ?-glucans and their benefits, to characterize them and discuss their potential to act in intestinal health as a bioactive polymer with prebiotic and immunomodulatory action. Together, the ?-1,3-glucanase enzyme was synthesized by the fungus T. harzianum Rifai. The specific substrates studied were: curdlan, succinoglycan, corn starch, cassava starch, fungal biomass and lactose. The substrates were evaluated in relation to production of ?-glucanases in the presence of T. harzianun Rifai fungus and the A. pullulan 1WA1 yeast, through the observation of hydrolysis halo in a Petri dish (zymogram). After screening the substrates by the qualitative technique of zymogram, enzyme production assays were carried out. The production of ?-1,3-glucanases was studied through the cultivation of T. harzianum Rifai using free and immobilized cells in synthetic sponges through repetitive batch processes. For microbial immobilization, natural and synthetic matrices were used, respectively, Luffa cylindrica bushing and synthetic polyurethane sponge. The matrices were prepared in disks form, each approximately 25 mm in diameter and thickness. Tests were also carried out for the synthesis of ?-1,3-glucanases with different concentrations of corn starch and cassava starch (0.15%; 0.5%; 1.0%; 3.0% and 5.0%), using only free cells. The ?-1,3-glucanase activity was determined by quantifying the reducing sugars released from the hydrolysis of the laminarin substrate, according to the cuproarsenate method described by Somogyi and Nelson. The unit of ?-1,3-glucanases activity was defined as the number of ?moL of reducing sugars released per minute per mL of enzyme extract under the test conditions. The results of the synthesis of ?-1,3-glucanases were submitted to analysis of variance (ANOVA) and the means were compared by the Tukey test, considering a significance level of 5% (p ? 0.05). RESULTS AND DISCUSSION. The zymogram method, which is a qualitative, low-cost, and fast technique, proved to be efficient for screening substrates inducing ?-glucanases against species of filamentous fungi. All substrates evaluated showed positive results for the method. It was possible to immobilize T. harzianum Rifai in sponge synthetic and natural. However, after exposing the natural sponge (L. cylindrica) to the fungus from the second repetitive batch of ?-1,3-glucanases production, started a process of degradation of the natural support, preventing its use. The degradation of the natural support was related to the potential of synthesis of xylanase and cellulase by T. harzianum. All tested substrates resulted in the synthesis of ?-1,3-glucanase, including succinoglycan, proposed innovatively in this study. Fungal biomass resulted in the best inducing substrate under conditions of free and immobilized cells, with a production of ?-1,3-glucanases of 0.73 U and 0.80 U, respectively. The good performance of fungal biomass as an inducing substrate was already expected since it is known in the literature that Trichoderma species synthesize a greater amount of extracellular ?-glucanases when cultivated in a medium containing fungal cell wall. Corn starch managed to maintain the production of ?-1,3-glucanases until the fourth batch was evaluated, showing itself to be an interesting substrate since it is currently the cheapest and most accessible in the market among those evaluated in this research. The synthesis of ?-1,3-glucanase using immobilized cells, in the first batch, about free cells, showed an increase in the production of ?-1,3-glucanases to observe an increase in the production of ?-1,3-glucanases for the inducing media fungal biomass, lactose, and succinoglycan with and without glucose, which reached an enzymatic concentration around 8.74%, 47.80%, 78.10%, and 46.90% higher, respectively. The substrates corn starch and cassava showed promise in the production of ?-1,3-glucanase. Corn starch showed the best result in this test and, for the two substrates studied, there was an increase in enzyme production against the increase in the concentration of up to 1.0% of the substrate, obtaining 0.51 U and 0.46 U for starch from corn and cassava starch, respectively. From 3% onwards, there was a decrease in the production of ?-1,3-glucanases for the two substrates. No significant difference was observed between corn and cassava starch when using concentrations of 0.5% and 1%. Similarities in production between substrates should be considered a relevant and positive factor, considering the possibility of replacing the raw material by industry in face of price variation, due to the seasonality of agricultural crops. CONCLUSION. It is possible to use the zymogram technique to screen for substrates inducing ?-1,3-glucanases. Fungal biomass resulted in good production of ?-1,3-glucanases, however, its acquisition is restricted. Starch sources showed promise for enzyme production by T. harzianum, being easy to acquire industrially and at a low cost. Succinoglycan can be used as an inducing substrate in the production of fungal ? -1,3-glucanases. The use of free and immobilized cells allowed the microorganism to be reused, allowing its use in repetitive batches. The use of ?-1,3-glucanases enables the best industrial use of ?-glucans with bioactive potential.