Obtenção de soro de leite humano e sua caracterização por CG-DIC e ESI-MS

Abstract

RESUMO: O leite, por definição, origina-se da glândula mamária de fêmeas mamíferas como fonte de alimentação para recém-nascidos, auxiliando no desenvolvimento do organismo e na sobrevivência. O leite humano deve ser a fonte alimentar exclusiva durante os primeiros seis meses de vida dos bebês, e caso a amamentação for interrompida por alguns fatores, a Academia Americana de Pediatria recomenda o uso de leite humano doado pasteurizado. O leite humano que não atender às especificações deve ser descartado diretamente na rede de esgoto, conforme estipulado na RDC/Anvisa n° 306/2004 (Brasil, 2004). Em 2019, todos os estados brasileiros apresentavam relatórios de dados estatísticos, fornecidos pelo banco de dados da rede brasileira de bancos de leite humano, que expõe um descarte médio de 20,0 a 30,0%. Os autores não têm conhecimento de nenhum trabalho que reaproveite esse leite humano residual para o desenvolvimento de co-produtos; contudo, estudos sobre isso serão promissores. O soro de leite é um derivado do leite, de cor amarelo claro a esverdeado, composto por lactose, proteínas solúveis, vitaminas, lipídios e minerais. Pode ser obtido a partir da separação/sedimentação da caseína das proteínas séricas do leite, por centrifugação (Silva et al., 2007) ou ultracentrifugação (Lu et al., 2018). Entre diversos estudos na literatura, são expostos estudos quais avaliam composição proteica e imunológicas referentes ao soro de leite humano, porém não há relatos sobre a composição lipídica do mesmo. OBJETIVOS. A fim de evitar o descarte deste produto e aplicá-lo na alimentação infantil, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o soro de leite humano derivado do leite descartado, por sujidade, do Banco de Leite Humano de Maringá (Paraná, Brasil), por meio de análises de composição de ácidos graxos (AG), perfil lipídico de triacilglicerol (TAG) e composição centesimal. MATERIAL E METODOS. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa número 2.797.476, da Universidade Estadual de Maringá. Amostras de leite humano maduro cru descartado por sujidade foram coletadas em temperatura de resfriamento de 4ºC, no Banco de Leite Humano do Hospital Universitário de Maringá. Posteriormente, o leite humano foi homogeneizado e produzido um pool. Foi acondicionado em embalagens de polietileno e armazenado a -18 °C para posterior desenvolvimento e análise do soro de leite. Obtenção de soro de leite humano: o leite foi centrifugado a 1500 g por 10 minutos a 10 ºC para remoção da camada de gordura. E o leite humano desnatado foi ultracentrifugado a 6000 g por 30 minutos a 30 ºC para sedimentar a caseína. Avaliação da composição centesimal, análises realizadas de umidade, cinzas, proteínas e carboidratos pelo cálculo da diferença; e conteúdo lipídico. O valor energético dos alimentos foi expresso pela soma dos macronutrientes que os compõem. Ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG) foram preparados por metilação dos lipídios totais para análise de composição em AG. E posteriormente analisado em cromatógrafo gasoso (CG, Trace Ultra 3300) com detector de ionização de chama (DIC), foi utilizado o modo de injeção dividida na proporção de 1: 100. Os EMAGs foram identificados comparando os tempos de retenção das amostras constituintes com os padrões analíticos. As composições de AG foram expressas como porcentagem relativa. A qualidade nutricional dos lipídios foi avaliada por 6 índices: índice de aterogenicidade (IA), índice de trombogenicidade (IT) e proporção de AG hipocolesterolêmico / hipercolesterolêmico (H / H). Soma da família ômega-6 devido à família ômega-3, soma dos ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) devido à soma dos ácidos graxos saturados (AGS), e soma dos AGs eicosapentaenóico (EPA) e AG docosahexaenóico (DHA). O perfil de Triacyglycerol (TAG) foi obtido por infusão direta em um MS usando uma fonte de ionização por electrospray (ESI). Os TAGs foram atribuídos e estimados (%) através da plataforma LAMES, que se baseia no algoritmo matemático que descreve a distribuição de AG em moléculas de TAG usando a porcentagem de AG determinada por CG-DIC. Com o banco de dados do Lipid maps®, foi possível encontrar uma fórmula molecular para os TAGs. Os dados de todas as demais análises foram submetidos à análise estatística de variância (ANOVA) e teste de Tukey (p<0,05). Todas análises comparadas a leite humano maduro (HM). RESULTADOS E DISCUSSÃO. A amostra com maior umidade foi HW (91,56 ± 0,07), enquanto HM (89,11 ± 0,13); o valor de HW é devido à remoção de matéria sólida (gordura e proteína) do leite humano durante o desnate. Para a porcentagem de cinzas HM (0,15 ± 0,01) e HW (0,15 ± 0,02) não apresentaram diferenças significativas entre si, pois ambos possuem a mesma quantidade de minerais. No teor de proteína total, a amostra de HM apresentou um valor de 1,29 ± 0,10, e a amostra de HW, houve uma diminuição na concentração de proteína (1,12 ± 0,05), devido à precipitação de caseína, que ocasionou uma redução na quantidade de proteína bruta total. Quanto aos lipídios, já era esperado um valor maior para HM (3,23 ± 0,13) em comparação ao HW (0,93 ± 0,13) devido ao processo de desnate para obtenção do mesmo. Os valores de carboidratos foram obtidos calculando a diferença de macronutrientes, consequentemente, os resultados foram HM (6,22 ± 0,23) e HW (6,24 ± 0,20). Na avaliação do valor energético foram verificadas perdas do valor total, devido à perda de lipídios e proteínas durante a obtenção do HW; HM obteve um valor de 59,10 ± 0,32 e HW 37,80 ± 0,31; entretanto para o consumo, a quantidade mínima recomendada para alimentação de lactentes é de 25 Kcal/100 mL. 32 AGs foram identificados pelo CG-DIC. Entre os AGs analisados, o ácido oleico (O, 18: 1n- 9) foi a maioria para ambas as amostras; HM (31,32 ± 0,49) e HW (32,28 ± 0,42). Em seguida, o ácido palmítico (P, 16: 0) com HW (28,09 ± 0,78) e HM (22,23 ± 0,08). Para os AGPIs, o identificado em maior quantidade foi o ácido linoléico (L, 18: 2n-6), considerado um AG estritamente essencial e precursor do ácido araquidônico (AA, 20: 4n-6) também encontrado nas amostras. Outros AGPI de cadeia longa também foram obtidos, como o ácido alfa-linolênico (aLn, 18: 3n-3), que é um precursor de eicosapentaenóico (EPA, 20:5n-3) e docosahexaenóico (DHA, 22: 6n- 3). Portanto, tanto HM quanto HW mantêm AGs estritamente essenciais, seus precursores e AGs essenciais. No entanto, é importante observar que o conteúdo essencial de AG aumentou no co-produto. AG C9, t11 e t10, C12, que são chamados de ácido linoléico conjugado, permaneceram presentes em todas as amostras. Uma vez obtido o soro, foi identificado aumento de C9, t11 e diminuição de t10, C12. A amostra HW apresentou o maior nível da soma dos ácidos graxos saturados (?AGS) (49,34 ± 0,49), e HM (43,58 ± 0,47). Para os ácidos graxos monoinsaturados (?AGMI), a amostra de HW foi predominante, com valor de 37,03 ± 0,17%. Por fim, para a soma dos ácidos graxos poliinsaturados (? AGPI) a amostra de HM se destacou, obtendo um resultado de 22,43 ± 0,04%. O índice de aterogenicidade (IA) apresentou a HM maior valor (0,98 ± 0,02), e HW apresentou o valor 0,91 ± 0,01; isso se deve ao fato de que no HW os valores de ? AGMI e n-3 são maiores em relação ao HM; as concentrações de 12:0e 14:0 também foram maiores na amostra HM do que na amostra HW, corroborando com o resultado. O índice de trombogenicidade (IT) teve valor obtido para HW (1,41 ± 0,09) e o menor para HM (1,07 ± 0,01). Não há valores de referência na literatura para IA e IT, esses índices indicam potencial para agregação plaquetária, portanto, níveis baixos são desejáveis. A proporção de hipocolesterolêmico/hipercolesterolêmico (H/H), valor encontrado para a amostra de HM (1,51 ± 0,04) e a menor foi para a amostra de HW (1,35 ± 0,04); a proporcionalidade de H/H indica os efeitos específicos dos AG no metabolismo do colesterol, valores acima de 2,0 são desejáveis, pois levam a maiores benefícios à saúde, prevenindo doenças cardiovasculares. Os valores encontrados estão abaixo de 2,0 para todas as amostras, devido ao ? AGS ser superior ao ? AGPI, ambos relacionados à dieta materna. A proporção de ? n-6 para ? n-3, tem proporção aceitável para o bom funcionamento do organismo está entre 5 e 10; HM obteve 13,01 ± 0,17, fora da proporção aceitável, enquanto a amostra HW apresentou valores dentro do parâmetro indicado (5,95 ±1,02). Essa relação é importante porque esses AGs competem pelas vias metabólicas de alongamento e dessaturação. AGPI/AGS mostrou resultados HM (0,51 ± 0,01) e HW (0,28 ± 0,01). Alimentos com uma relação AGPI/AGS abaixo de 0,45 foram considerados não saudáveis devido ao seu potencial de induzir aumentos de colesterol no sangue; apenas o HM apresentou valores acima do valor mencionado. O ? (EPA) + (DHA), HW (0,73 ± 0,13) e o HM (0,20 ± 0,02); no entanto, a presença de ambos os AGs nas amostras é extremamente importante. Os resultados da determinação do TAG realizada por infusão direta em ESI-MS tiveram o pico espectral iônico mais intenso presente entre m / z 876 e 877. Os resultados do TAG mostram o pool de leite humano (HM) e soro de leite humano (HW) espectros obtidos por esta análise na faixa m / z de 530 a 1100. No espectro HM, os picos iônicos são mais intensos em comparação com HW, uma vez que a porcentagem de lipídios na amostra HM é maior (3,23 ± 0,13) do que HW (0,93 ± 0,13). Foram encontrados os 21 maiores índices m / z, com seus respectivos TAGs, encontrados na região entre 792 a 916 m / z, pela Plataforma LAMES. Comparando os resultados obtidos pela composição de AG, com os TAGs apresentados, foi possível observar a frequência dos ácidos oléico (O,18: 1n-9) e palmítico (P, 16: 0) nos TAGs, que são aqueles com as maiores concentrações em relação ao AG. A porcentagem de TAGs na amostra HW em relação à amostra HM variou devido à sua distribuição nos glóbulos de gordura, à medida que a ultracentrifugação era realizada, os presentes na caseína diminuíam sua porcentagem [TAG + NH4] + LaOP, MOP, PLP, MOO, PLO e OLO. Enquanto aqueles associados à albumina, fração solúvel no soro ([TAG + NH4] + PPP, POP, SPP, PVcO, POO, SLP, SOP, SPS, SOS, OOO, SLO, SOO, BhOP) mostraram uma alta porcentagem, isto é justificado porque os lipídios que permaneceram na fração líquida tiveram seu percentual reequilibrado. CONCLUSÕES. Com a realização deste trabalho pode-se concluir que foi possível obter um coproduto do leite humano descartado pelos bancos de leite; o soro de leite humano (HW). Os resultados obtidos revelaram que a composição química sofreu alterações significativas uma vez que o HW foi obtido a partir do HM, exceto para o percentual de cinzas e carboidratos. Em relação à composição dos ácidos graxos, observou-se que os ácidos graxos estritamente essenciais, ácidos graxos essenciais e todos os demais AGs encontrados no HM permaneceram presentes na HW, sendo de extrema importância, visto que esses AGs são responsáveis por diversos benefícios à saúde dos lactentes, como já demonstrado. No que se refere à qualidade nutricional lipídica, tanto o IA quanto o IT apresentaram valores adequados para ambas as amostras, indicando uma qualidade alimentar lipídica e seus potenciais efeitos no desenvolvimento de doenças coronarianas. Por fim, o perfil lipídico dos TAGs apresentou variação nas amostras analisadas, com maior percentual de ácidos graxos saturados e monoinsaturados, o que é importante, pois auxilia no processo de digestão dos lactentes. Portanto, o HW tem potencial para aplicação tanto na forma isolada quanto como utilizado em outros alimentos.

ABSTRACT: Milk, by definition, originates from the mammary gland of female mammals as a source of food for newborns, aiding in the development of the organism and in survival. Human milk should be the exclusive food source during the first six months of a baby's life, and if breastfeeding is interrupted by some factors, the American Academy of Pediatrics recommends the use of pasteurized donated human milk. Human milk that does not meet the specifications must be disposed of directly in the sewage network, as stipulated in RDC / Anvisa n. 306/2004 (Brazil, 2004). In 2019, all Brazilian states presented reports of statistical data, provided by the database of the Brazilian network of human milk banks, which exposes an average disposal of 20.0 to 30.0%. The authors are not aware of any work that reuses this residual human milk for the development of coproducts; however, studies on this will be promising. Whey is a derivative of milk, light yellow to greenish in color, composed of lactose, soluble proteins, vitamins, lipids and minerals. It can be obtained from the separation / sedimentation of casein from serum Milk proteins, by centrifugation (Silva et al., 2007) or ultracentrifugation (Lu et al., 2018). Among several studies in the literature, studies are exposed that assess protein and immunological composition referring to human whey, however there are no reports on its lipid composition. OBJECTIVES. In order to avoid the disposal of human whey and apply it to infant feeding, the aim of this work was to characterize the human whey derived from human Milk discarded by dirt from the Human Milk Bank of Maringá (Paraná, Brazil), through analysis of fatty acid (FA) composition, triacylglycerol (TAG) lipid profile and proximate composition. MATERIAL AND METHODS. This study was approved by the Research Ethics Committee number 2.797.476, of Universidade Estadual de Maringá. Samples of raw mature human milk discarded by dirt were collected at a cooling temperature of 4 ºC, at the Human Milk Bank of Hospital Universitário de Maringá. Subsequently, human milk was homogenized and a pool was produced. It was packed in polyethylene packaging and stored at -18 °C for further development and analysis of human whey. Obtaining human whey: the milk was centrifuged at 1500 g for 10 minutes at 10 ºC to remove the fat layer. The skimmed human milk was ultracentrifuged at 6000 g for 30 minutes at 30 ºC to sediment casein. Assessment of centesimal composition, analyzes of moisture, ash, protein and carbohydrates by calculating the difference; and lipid content. The energy food value was expressed by the sum of the macronutrients that comprise it. Fatty acid methyl esters (FAME) were prepared by total lipids methylation for composition analysis in FA. And later analyzed in a gas chromatograph (GC, Trace Ultra 3300) with flame ionization detector (FID), the split injection mode was used in the proportion of 1:100. The FAMEs were identified by comparing the retention times of the constituent samples with analytical standards. The FA compositions were expressed as relative percentage. The lipids nutritional quality was assessed by 6 indices: atherogenicity index (AI), thrombogenicity index (TI) and proportion of FA hypocholesterolemic/hypercholesterolemic (H/H). Sum of the omega-6 family due to the omega-3 family, sum of polyunsaturated fatty acids (PUFA) due to the sum of saturated fatty acids (SFA), and sum of eicosapentaenoic (EPA) FA and docosahexaenoic (DHA) FA. The triacyglycerol (TAG) profile was obtained by direct infusion into a mass spectrometry (MS) using electrospray ionization (ESI) source. TAGs were assigned and estimated (%) through the LAMES platform, which is based on the mathematical algorithm that describes the distribution of FA in TAG molecules using the FA percentage determined by GC-FID. With the Lipid maps® database, it was possible to find a molecular formula for TAGs. The data from all other analyzes were submitted to statistical analysis of variance (ANOVA) and Tukey's test (p <0.05). All analyzes were compared to mature human milk (HM). RESULTS AND DISCUSSION. The sample with the highest moisture was HW (91.56±0.07), while HM (89.11±0.13); the HW value is due to the removal of solid matter (fat and protein) from human milk during skimming. For percentage of ash, the values were: HM (0.15±0.01) and HW (0.15±0.02), there were no significant differences between it, as both samples have the same monerals amount. In the total protein content, the HM sample showed a value of 1.29±0.10, and the HW sample, there presented a decrease in the protein concentration (1.12±0.05), due to the casein precipitation, which caused a reduction in the total crude protein amount. As for lipids, a higher value for HM (3.23±0.13) in comparison to HW (0.93±0.13) was already expected due to the creaming process. For the carbohydrate, the results were HM (6.22±0.23) and HW (6.24±0.20). In the energy value evaluation, losses of the total value were verified, due to the loss of lipids and proteins during obtaining the HW; HM obtained a value of 59.10±0.32 and HW 37.80±0.31; however, for consumption, the minimum recommended amount for feeding infants is 25 Kcal/100 mL. 32 FAs were identified by the GC-FID. Among the FAs analyzed, oleic acid (O, 18:1n-9) was the majority for both samples; HM (31.32±0.49) and HW (32.28±0.42). Then, palmitic acid (P, 16:0) with HW (28.09±0.78) and HM (22.23±0.08). For PUFAs, the FA identified in greater quantity was linoleic acid (L, 18:2n-6), considered a strictly essential FA and precursor of the arachidonic acid (AA, 20:4n-6) also found in the samples. Other long-chain PUFAs have also been obtained, such as alpha-linolenic acid (aLn, 18:3n-3), which is a precursor of the eicosapentaenoic (EPA, 20:5n-3) and docosahexaenoic (DHA, 22:6n-3). Therefore, both HM and HW maintain strictly essential FAs, its precursors and essential FAs. However, it is important to note that the essential FA content has increased in the co-product. FA C9,t11 and t10,C12, which are named conjugated linoleic acid, remained present in all samples. Once the serum was obtained, an increase in C9,t11 and a decrease in t10,C12 was identified. The HW sample showed the highest level of the saturated fatty acids sum (?SFA) (49.34±0.49), and HM (43.58±0.47). For monounsaturated fatty acids sum (?MUFA), the HW sample was predominant, with a value of 37.03±0.17%. Finally, for the polyunsaturated fatty acids sum (?MUFA) the HM sample stood out, obtaining a result of 22.43±0.04%. The atherogenicity index (AI) had the highest value for HM sample (0.98±0.02) and HW sample presented a value of 0.91±0.01; because of the ?MUFA and n-3 values in the HW samples are higher in relation to HM; the 12:0 and 14:0 concentrations were also higher in the HM sample, corroborating with the result. The thrombogenicity index (TI) presented a value of 1.41±0.09 for HW sample and a lowest value for HM sample (1.07±0.01). There are no reference values in the literature for AI and TI, these indices indicate potential for platelet aggregation, therefore, low levels are desirable. The hypocholesterolemic/hypercholesterolemic (H/H) proportion, the value found were: HM sample (1.51±0.04) and a lowest value for the HW sample (1.35±0.04); the H/H proportionality indicates the FA specific effects on cholesterol metabolism, values above 2.0 are desirable, as it leads to greater health benefits, preventing cardiovascular diseases. The values found are below 2.0 for all samples, becausa the ?SFA were higher than the ?MUFA, both values related to the maternal diet. The ratio of ?n-6 to n-3, has na acceptable proportion for the proper functioning of the organism is between 5 and 10; HM obtained 13.01 ± 0.17, outside the acceptable proportion, while the HW sample presented values within the indicated parameter (5.95 ± 1.02). This relationship is important because these FAs compete for the metabolic pathways of stretching and desaturation. PUFA/ SFA showed HM (0.51 ± 0.01) and HW (0.28 ± 0.01) results. Foods with an PUFA/SFA ratio below 0.45 were considered unhealthy because of their potential to induce increases in blood cholesterol; only the HM presented values above the mentioned value. ? (EPA) + (DHA), HW (0.73 ± 0.13) and HM (0.20 ± 0.02); however, the presence of both FAs in the samples is extremely important. The ?n-6 to? n-3 ratio has an acceptable proportion for the proper organism functioning between 5 and 10; HM obtained 13.01±0.17, outside the acceptable proportion, while the HW sample presented values within the indicated parameter (5.95±1.02). This relationship is important because these FAs compete for the metabolic pathways of stretching and desaturation. PUFA/SFA showed HM (0.51±0.01) and HW (0.28±0.01) results. Foods with PUFA/SFA ratio below 0.45 are considered unhealthy because of its potential to induce increases in blood cholesterol; only the HM presented values above the mentioned value. ?(EPA)+(DHA), HW (0.73±0.13) and HM (0.20±0.02); however, the presence of both FAs in the samples is extremely important. The TAG results show the HM and HW spectra obtained by direct infusion in ESI-MS in the m/z range from 530 to 1100, with the most intense ionic spectral peak present between m/z 876 and 877. In the HM spectrum, the ionic peaks are more intense compared to HW, since the lipids percentage in the HM sample is higher (3.23±0.13) than HW (0.93 ± 0.13). The 21 largest indexes m/z were found, with its respective TAGs, found in the region between m/z 792 to 916, by the LAMES Platform. Comparing the results obtained by the Faz composition, with the presented TAGs, it was possible to observe the frequency of oleic (O,18:1n-9) and palmitic (P, 16:0) FAs in TAGs, both with highest concentrations in relation to the FAs. The TAGs percentage in the HW sample in relation to the HM sample varied due to its distribution in the fat globules, as the ultracentrifugation was performed, those present in the casein decreased its percentage [TAG+NH4]+ LaOP, MOP, PLP, MOO , PLO and OLO. While those associated with albumin, fraction soluble in serum ([TAG+NH4]+ PPP, POP, SPP, PVcO, POO, SLP, SOP, SPS, SOS, OOO, SLO, SOO, BhOP) showed a high percentage, justified because the lipids that remained in the liquid fraction had its percentage rebalanced. CONCLUSIONS. It is possible to obtain a human milk co-product from milk discarded by the human milk banks; the human whey (HW). The results obtained revealed that the chemical composition underwent significant modifications since the HW was obtained from the HM, except for the percentage of ash and carbohydrates. Regarding the fatty acids composition, it was observed that strictly essential fatty acids, essential fatty acids and all other FAs found in HM remained present in HW, being extremely important, since these FAs are responsible for several benefits in the infants' health, as already demonstrated. Considering the lipid nutritional quality, both the AI and the TI presented adequate values for both samples, indicating a lipid food quality and its potential effects on the development of coronary diseases. Finally, the TAGs lipid profile showed variation in the samples analyzed, with higher percentage of saturated and monounsaturated fatty acids, which is important, as it assists in the infants' digestion. Therefore, HW has the potential to be applied isolated or to be used in other foods.