Identificação molecular e caracterização patogênica de isolados de Fusarium spp. associados a podridão da coroa e raiz do trigo no Sul do Paraná

Abstract

RESUMO: O trigo é um cereal fundamental para o consumo humano e a alimentação animal. As doenças fúngicas limitam a produção mundial de trigo, com destaque para a podridão da coroa e raiz, causada por um complexo de patógenos, principalmente fungos do gênero Fusarium. Este trabalho teve como objetivo isolar fungos de Fusarium spp. associados à podridão da coroa e raiz em plantas de trigo coletadas em uma lavoura experimental no Sul do Paraná, realizar a identificação molecular através de sequências de DNA dos genes tef1, rpb1 e rpb2, e testar a patogenicidade desses isolados em plântulas de trigo. As plantas de trigo para análise foram colhidas na fase de maturação fisiológica. No laboratório foram selecionadas plantas ao acaso, das quais se retiraram fragmentos de raízes com sintoma de necrose. Os fragmentos foram submetidos a desinfestação superficial e depositados em placas de Petri contendo meio BDA. Após o crescimento dos fungos presentes nas raízes, foram selecionadas colônias com características de Fusarium spp. No total, selecionou-se 29 colônias, as quais foram purificas através do método de pontas de hifas. Em seguida, foi realizada a extração de DNA dos isolados. Para a identificação molecular inicial, foi amplificado com a reação da polimerase em cadeia um segmento do gene tef1. O resultado do sequenciamento desse gene permitiu separar os isolados em dois complexos de espécies através da comparação com estirpes referências depositadas em bancos de dados. A identificação dos isolados do complexo de espécies Fusarium graminearum (FGSC) foi complementada com a amplificação parcial dos genes rpb1 e rpb2, e dos isolados do complexo de espécies Fusarium oxysporum (FOSC) com amplificação do gene rpb2. O teste de patogenicidade foi realizado com todos os isolados obtidos. Para produzir o inóculo, os isolados foram cultivados por 7 dias em placas com BDA, e 5 plugs miceliais foram inoculados em grãos de trigo autoclavados. O inóculo foi incubado por 14 dias para a colonização homogênea dos grãos e, depois, triturado. experimento foi realizado em bandejas, com cada célula representando uma repetição, totalizando 4 repetições por tratamento. O trigo foi plantado em areia autoclavada, com uma camada de areia em todas as células, seguida pelas sementes de trigo e 1g de inóculo por cima. O controle negativo utilizou grãos de trigo estéreis sem inoculação, e o controle positivo consistiu de F. graminearum e F. meridionale. A bandejas foram mantidas em sala de crescimento por 28 dias. A avaliação da severidade da podridão da coroa e raiz foi realizada através de uma escala de notas, variando de 0 (planta sadia) até 5 (semente não germinada). O resultado da identificação molecular mostrou que 18 isolados pertenciam ao FGSC e 11 ao FOSC. Dentro do FGSC, foram identificados F. graminearum, F. meridionale e F. cortaderiae, enquanto para o FOSC não foi possível a identificação ao nível de espécie. No teste de patogenicidade os dados foram submetidos a análise de homogeneidade e normalidade. Na análise de variância conjunta dos experimentos observou que houve diferença significativa a 1% de probabilidade. A análise de contraste ortogonais mostrou que os isolados pertencentes ao FGSC foram mais agressivos quando comparados com os isolados do FOSC. Os resultados obtidos são importantes para compreender a população de patógenos que estão associados a podridão da coroa e raiz e projetar manejos de controle eficazes.

ABSTRACT: Wheat is a fundamental cereal for human consumption and animal feed. Fungal diseases limit global wheat production, with crown and root rot being particularly significant. This disease is caused by a complex of pathogens, primarily fungi of the genus Fusarium. This study aimed to isolate Fusarium spp. Fungi associated with crown and root rot in wheat plants collected from an experimental farm in southern Paraná, conduct molecular identification using DNA sequences of the tef1, rpb1 and rpb2 genes, and test the pathogenicity of these isolates in wheat seedlings. Wheat plants for analysis were harvested at the physiological maturity stage. In the laboratory, plants were randomly selected, and root fragments were taken. These fragments were superficially disinfected and placed in Petri dishes containing BDA medium. After the growth of fungi present in the roots, colonies with characteristics of Fusarium spp. were selected. In total, 29 colonies were selected and purified using the hyphal tip method. DNA extraction was performed on all isolates. For molecular identification, the tef1 gene was amplified. The sequencing results of this gene allowed the separation of isolates into two species complexes by comparison with reference strains deposited in databases. The isolates of the Fusarium graminearum species complex (FGSC) proceeded to amplify the rpb1 and rpb2 genes, while the isolates of the Fusarium oxysporum species complex (FOSC) amplified only rpb2. The pathogenicity test was conducted with all obtained isolates. To produce the inoculum, the isolates were cultured for 7 days on BDA plates, and 5 mycelial plugs were inoculated into autoclaved wheat grains. The inoculum was incubated for 14 days for homogeneous colonization of the grains and then ground. The experiment was conducted in trays, with each cell representing a repetition, totaling 4 repetitions per treatment. Wheat was planted in autoclaved sand, with a layer of sand in all cells, followed by wheat seeds and the inoculum on top. The negative control used sterile wheat grains without inoculation, and the positive control consisted of F. graminearum and F. meridionale. The trays were kept in a growth room for 28 days. The severity of crown and root rot was assessed using a rating scale ranging from 0 (healthy plant) to 5 (ungerminated seed). The molecular identification results showed 18 fungi from the FGSC and 11 from the FOSC. Within the FGSC, F. graminearum, F. meridionale, and F. cortaderiae were identified, while species-level identification was not possible for the FOSC. In the pathogenicity test, the data were subjected to homogeneity and normality analysis. The joint analysis of variance of the experiments showed a significant difference at a 1% probability. Orthogonal contrast analysis indicated that the isolates belonging to the FGSC were more aggressive compared to the FOSC isolates. The obtained results are importante for understanding the pathogen population and designing effective control management strategies.