Entre a terapêutica e a toxicidade: análise dos efeitos sistêmicos da artrite induzida por adjuvante e seu tratamento

Abstract

Resumo: Introdução: A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune, inflamatória crônica, caracterizada pela infiltração da membrana sinovial, em diversas articulações. A qual também é marcada pela infiltração de monócitos e células T e B, produção de autoanticorpos, ativação das células endoteliais, neovascularização e a hiperplasia do revestimento sinovial. Essa patologia também está ligada a complicações sistêmicas gerando alterações renais, cardíacas e pulmonares. Assim, diversos medicamentos são utilizados no tratamento da AR, como o Metotrexato (MTX) que apesar de baixo custo e eficácia na atenuação da doença apresenta diversos efeitos colaterais. Desta forma, o uso de substancias naturais junto ao tratamento com MTX pode trazer muitos benefícios. Como a curcumina, extraída da Curcuma Longa e que apresenta ações antirreumáticas, anti-inflamatórias e antioxidantes. A curcumina apesar de muito vantajosa, tem como limitação uma baixa biodisponibilidade. Assim o uso de nanoemulsões, sistemas carreadores para drogas lipossolúveis, oferecem maior potencialização na distribuição, absorção e estabilidade da curcumina, sendo uma forma de tecnologia em ascensão. Objetivo: avaliar os efeitos do uso da curcumina livre (CL), curcumina nanoemulsificada (CN) e MTX, de forma isolada e associativa, sobre os rins, coração e pulmões de ratos Holztman, em modelo experimental de artrite induzida por adjuvante (AIA). Metodologia: o estudo recebeu a aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (protocolo nº 2012070222) onde foram utilizados 42 ratos da linhagem Holtzman divididos em sete grupos: controle (CONT), AIA - sem tratamento, AIA+CL (tratamento com curcumina livre), AIA+CN (tratamento com nanoemulsão), AIA+MTX (tratamento com MTX), AIA+CL+MTX (tratamento com curcumina livre e MTX), AIA+CN+MTX (tratamento com nanoemulsão e MTX). Os tratamentos foram realizados via gavagem, onde os grupos CONT e AIA receberam 2,5 ml de água/dia, todos os grupos tratados com CL ou CN receberam 30 mg/kg de curcumina diariamente e todos os grupos tratados com MTX receberam 1mg/kg do medicamento uma vez por semana. A doença foi induzida por Adjuvante completo de Freund e o desenvolvimento da AIA foi verificado por medida das patas dos animais e analises sanguíneas. Após sete dias da indução tiveram início os tratamentos e período experimental que durou 30 dias. Após a eutanásia os rins, coração e pulmões foram coletados e segmentados para analises histológicas, de marcadores oxidativos e inflamatórios. Resultados e discussões: a AIA foi estabelecida e levou ao aumento do volume das patas, aparições de lesões secundárias e aumento de células inflamatórias na corrente sanguínea dos animais. Entre os tratamentos empregados, o uso de CN foi o que proporcionou mais benefícios das alterações artríticas, evidenciando seus benefícios nos parâmetros gerais da AIA. Nos marcadores renais a AIA aumentou os níveis de ureia, o que já foi citado como parte de uma disfunção renal associada a artrite e ação sinérgica do uso concomitante da curcumina e MTX mostrou-se benéfico ao reduzir esses níveis. Nas avaliações do estresse oxidativo renal, a AIA não promoveu alterações significativas, exceto pelo aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e na atividade da mieloperoxidade (MPO), a qual é considerada como marcador inflamatório. Contudo os tratamentos utilizados geraram modificações no estado redox renal. O uso da CN promoveu diminuição exacerbada da peroxidação lipídica, dada pela quantificação de hidroperóxidos lipídicos, assim como aumentou os níveis do antioxidante glutationa (GSH). A GSH se manteve elevada nos grupos AIA+MTX e AIA+CL+MTX. O grupo AIA+MTX também reduziu a atividade da catalase (CAT), glutationa-s-transferase (GST) e superóxido dismutase (SOD), dados semelhantes a outros estudos que apontaram que o fármaco tem capacidade de reduzir a atividade de enzimas do sistema antioxidante. Além disso o uso de MTX diminuiu a disponibilidade do óxido nítrico (NO), mensurado pelos níveis de nitrito, o que já foi descrito como prejudicial em quadros de patologias renais. O que evidencia ainda mais a atenção a um possível dano renal atribuído ao uso de MTX. Um outro achado importante, foi que houve o aumento da atividade da N-acetil-?-D-glicosaminidase (NAG) nos grupos AIA+CL+MTX e AIA+CN+MTX. Tal enzima é considerada uma potencial marcadora de injurias dos túbulos contorcidos proximais, fato que está em concordância com a medida aumentada do diâmetro tubular nestes mesmo tubos, demonstrando que esse tratamento associativo de fato desencadeou lesões tubulares. Assim apesar da AIA não ter ocasionado grandes alterações bioquímicas renais, foram vistas diversas modificações morfológicas: hipertrofia na área do corpúsculo renal, do glomérulo e túbulos contorcidos proximais. Inclusive, os grupos AIA+CL+MTX e AIA+CN+MTX tiveram aumento mais exacerbado em ambos os túbulos contorcidos, o que pode estar associado a hiperfiltração glomerular, esta possibilidade é reforçada pelo aumento da GSH no grupo AIA+CL+MTX e NAG em ambos os grupos com curcumina e MTX. Além disso o uso de CN levou a redução da massa dos rins e da área do espaço capsular, apontando que a própria nanoemulsão pode ser prejudicial ao tecido renal. Destaca-se o uso combinado de CN com MTX, que, além da maior hipertrofia tubular, também resultou em atrofia da área do glomérulo e cápsula glomerular. Em relação ao coração, os ratos submetidos a AIA apresentaram diminuição da massa cardíaca, redução da área do perfil neuronal e aumento da disposição de colágeno do sistema nervoso cardíaco intrínseco (ICNS), uma rede de inervação cardíaca indispensável para a função do coração. Além disso, observou-se hipertrofia no diâmetro de cardiomiócitos e indução de fibrose, alterações frequentemente relatadas em quadros de remodelação cardíaca. No INCS, o uso isolado de MTX foi benéfico na normalização da distribuição de colágeno e da área do perfil celular. No entanto, mostrou-se potencialmente danoso, pois levou a diminuição da densidade neuronal. Assim, aumento da área do perfil neuronal em relação ao grupo AIA foi um efeito compensatório na redução da densidade neuronal. O uso da CN em associação com MTX não foi capaz de atenuar esse quadro de neurodegeneração, mostrando que essa combinação também não foi vantajosa para o ICNS. No que se refere ao tamanho dos cardiomiócitos a terapia com CL isolada foi eficaz para reduzir os aumentos promovidos pela AIA. De forma semelhante a distribuição de colágeno total do ICNS o uso isolado do MTX isolado reverteu a fibrose desencadeada pela AIA. Neste caso nenhum tratamento com curcumina foi benéfico na atenuação da fibrose. No que se refere ao estresse oxidativo no coração, a AIA diminuiu os níveis de GSH e da atividade enzimática da SOD, aumentou os níveis das ROS e RNS, gerando um desbalanço redox, mas sem um dano oxidativo. Dentre os tratamentos empregados o uso de CN em associação com MTX foi o mais prejudicial em um contexto geral, pois além das alterações vistas no ICNS levou a uma atividade muito diminuída de GST, SOD, MPO e aumentou a atividade da NAG. Por fim, no tecido pulmonar a AIA resultou em alterações discretas. Promoveu atrofia da parede alveolar, fato já relacionado com mecanismos de apoptose, estresse mecânico e lesão tóxica, levando ao comprometimento das trocas gasosas e da função pulmonar. Além disso, a AIA induziu níveis reduzidos de peroxidação lipídica, diminuiu os níveis de NO e aumentou a atividade da MPO, sugerindo um quadro de estresse celular associado a um processo inflamatório. Por outro lado, as linhas de tratamento geraram desequilíbrios oxidativos, especialmente no grupo AIA+CN+MTX que elevou a peroxidação lipídica, os níveis de ROS e de antioxidantes enzimáticos endógenos levando ao estresse oxidativo. Com base nesse achado é importante analisar de forma mais criteriosa se os componentes da nanoemulsão podem induzir estresse oxidativo, sensibilizando as células pulmonares e tornando-as mais vulneráveis aos efeitos tóxicos do MTX. Conclusão: Além de promover manifestações articulares a AIA, após um período de 30 dias, foi capaz de desencadear alterações sistêmicas relevantes com impacto maior no coração, além dos rins e pulmões. Outro achado muito relevante foi que apontamos que o ICNS é comprometido pela AIA, o que pode contribuir para os danos cardíacos já associados a essa inflamação sistêmica. E que também o MTX tem um efeito neurotóxico sobre os neurônios desta inervação cardíaca. Assim, embora os tratamentos CL, CN e MTX, isolados ou associados, tenham promovido efeitos terapêuticos pontuais, os achados indicam que especialmente o uso sinérgico de CN e MTX exigem cautela, pois seu uso mostrou-se o mais potencialmente tóxico. Desta forma, embora a CN demonstre benefícios anti-inflamatórios em parâmetros artríticos gerais, sua interação com o MTX pode intensificar efeitos adversos, especialmente em tecidos não articulares. Esses resultados ressaltam a importância de se considerar os efeitos sistêmicos dos tratamentos antirreumáticos e apontam para a necessidade de ajustes nas formulações e dosagens, especialmente em pacientes com comorbidades renais, cardíacas ou pulmonares.

Abstract: Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune and inflammatory disease, characterized by the infiltration of the synovial membrane in several joints. It is also marked by the infiltration of monocytes and T and B cells, production of autoantibodies, activation of endothelial cells, neovascularization, and hyperplasia of the synovial lining. This pathology is also linked to systemic complications, leading to renal, cardiac, and pulmonary alterations. Thus, several drugs are used in RA treatment, such as Methotrexate (MTX) which, despite its low cost and effectiveness in attenuating the disease, presents several side effects. Therefore, the use of natural substances in combination with MTX treatment may bring many benefits, such as curcumin, extracted from Curcuma longa, which exhibits antirheumatic, anti-inflammatory, and antioxidant actions. Despite being highly advantageous, curcumin has the limitation of low bioavailability. Therefore, the use of nanoemulsions, carrier systems for liposoluble drugs, offers greater potential in distribution, absorption, and stability of curcumin, being an emerging technology. Objective: To evaluate the effects of free curcumin (FC), nanoemulsified curcumin (NC), and MTX, both isolated and in combination, on the kidneys, heart, and lungs of Holtzman rats in an adjuvant-induced arthritis (AIA) experimental model. Methodology: The study was approved by the Animal Ethics Committee (protocol nº 2012070222), and 42 Holtzman rats were used, divided into seven groups: control (CONT), AIA - untreated, AIA+FC (treatment with free curcumin), AIA+NC (treatment with nanoemulsion), AIA+MTX (treatment with MTX), AIA+FC+MTX (treatment with free curcumin and MTX), AIA+NC+MTX (treatment with nanoemulsion and MTX). Treatments were performed by gavage: CONT and AIA groups received 2.5 ml of water/day, all groups treated with FC or NC received 30 mg/kg of curcumin daily, and all groups treated with MTX received 1 mg/kg of the drug once a week. The disease was induced by Complete Freund's Adjuvant, and the development of AIA was verified by measurement of paw swelling and blood analyses. Seven days after induction, treatments and the experimental period began, lasting 30 days. After euthanasia, the kidneys, heart, and lungs were collected and processed for histological, oxidative, and inflammatory marker analyses. Results and discussion: AIA was established, leading to increased paw volume, the appearance of secondary lesions, and elevated inflammatory cells in the bloodstream. Among treatments, NC provided the greatest benefits regarding arthritic alterations, highlighting its positive effects on general AIA parameters. Regarding renal markers, AIA increased urea levels, already cited as part of renal dysfunction associated with arthritis, and the synergistic action of curcumin and MTX proved beneficial by reducing these levels. In renal oxidative stress evaluations, AIA did not cause significant changes, except for increased reactive oxygen species (ROS) levels and myeloperoxidase (MPO) activity, considered an inflammatory marker. However, treatments induced changes in renal redox status. NC reduced lipid peroxidation (measured by lipid hydroperoxides) and increased glutathione (GSH) levels. GSH remained elevated in the AIA+MTX and AIA+FC+MTX groups. The AIA+MTX group also reduced catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST), and superoxide dismutase (SOD) activity, similar to other studies reporting that the drug decreases antioxidant enzyme activity. Moreover, MTX reduced nitric oxide (NO) availability (measured by nitrite levels), described as harmful in renal pathologies, highlighting a possible renal injury due to MTX. Another relevant finding was the increased activity of N-acetyl-?-D-glucosaminidase (NAG) in AIA+FC+MTX and AIA+NC+MTX groups. This enzyme is considered a potential marker of proximal convoluted tubule injury, corroborated by the increased tubular diameter observed in these same groups, indicating that combined treatments triggered tubular lesions. Thus, although AIA did not cause major renal biochemical changes, several morphological modifications were seen: hypertrophy of the renal corpuscle, glomerulus, and proximal convoluted tubules. Particularly, AIA+FC+MTX and AIA+NC+MTX groups exhibited more pronounced increases, possibly associated with glomerular hyperfiltration, supported by increased GSH (AIA+FC+MTX) and NAG (both curcumin+MTX groups). Furthermore, NC reduced kidney mass and capsular space area, suggesting that nanoemulsion itself may be harmful to renal tissue. The combined use of NC and MTX also resulted in glomerular and capsular atrophy, along with greater tubular hypertrophy. Regarding the heart, AIA rats presented decreased cardiac mass, reduced neuronal profile area, and increased collagen deposition in the intrinsic cardiac nervous system (ICNS), an essential innervation network for heart function. Moreover, cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis were observed, changes frequently associated with cardiac remodeling. In the ICNS, isolated MTX use normalized collagen distribution and cellular profile area. However, it was potentially harmful, as it decreased neuronal density. Thus, the increased neuronal profile area in AIA compared to controls may represent a compensatory effect to reduced neuronal density. The NC+MTX combination failed to attenuate this neurodegeneration, showing no advantage for the ICNS. Regarding cardiomyocyte size, isolated FC reduced AIA-induced hypertrophy. Similarly, isolated MTX reversed ICNS fibrosis. In this case, curcumin treatments were not beneficial in fibrosis attenuation. Regarding cardiac oxidative stress, AIA reduced GSH levels and SOD activity while increasing ROS and reactive nitrogen species (RNS), leading to redox imbalance without oxidative damage. Among treatments, NC+MTX was the most harmful, as it worsened ICNS alterations, significantly reduced GST, SOD, and MPO activity, and increased NAG activity. In lung tissue, AIA caused mild changes, including alveolar wall atrophy, already linked to apoptosis, mechanical stress, and toxic injury, impairing gas exchange and pulmonary function. AIA also reduced lipid peroxidation, decreased NO levels, and increased MPO activity, indicating a cellular stress linked to inflammation. Conversely, treatments caused oxidative imbalances, especially AIA+NC+MTX, which increased lipid peroxidation, ROS levels, and endogenous antioxidant enzymes, leading to oxidative stress. Based on this finding, it is important to analyze more carefully whether nanoemulsion components may induce oxidative stress, sensitizing pulmonary cells and making them more vulnerable to MTX toxicity. Conclusion: Besides joint manifestations, AIA after 30 days triggered relevant systemic alterations, mainly in the heart, but also in kidneys and lungs. Another highly relevant finding was that AIA compromised the ICNS, which may contribute to cardiac damage associated with systemic inflammation, and that MTX exerts neurotoxic effects on cardiac innervation neurons. Thus, although FC, NC, and MTX treatments, isolated or combined, promoted specific therapeutic effects, findings indicate that especially the synergistic use of NC and MTX requires caution, as this combination proved the most potentially toxic. Therefore, although NC demonstrates anti-inflammatory benefits in general arthritic parameters, its interaction with MTX may intensify adverse effects, particularly in non-articular tissues. These results highlight the importance of considering systemic effects of antirheumatic treatments and the need for adjustments in formulations and dosages, especially in patients with renal, cardiac, or pulmonary comorbidities.