Padrão de expressão do gene kin17 em Pseudolycoriella hygida

Abstract

Resumo: Pseudolycoriella hygida é um inseto que compõe a ordem Diptera e a Família Sciaridae, na qual grande parte de seus representantes são de tamanho pequeno e são encontrados em ambientes úmidos. Os principais organismos que compõe esta família vêm sendo usados em estudos que envolvem a análise de genes e genomas, tais como processos de amplificação gênica, de telômeros, morte celular e estudos imunológicos. O inseto alvo nesse estudo apresenta um desenvolvimento holometábolo mantido em temperatura controlada de 20ºC, denotando a presença de metamorfose completa. Psl. hygida exibe em seu estádio larval 4 diferentes instares, delimitados pelo processo de muda pela troca do seu exoesqueleto quitinoso. Ao longo do seu instar larval observa-se a presença de um par de glândulas salivares constituídas de três porções diferentes, S1, S2 e S3. As glândulas salivares do inseto compõem um tecido formado por uma única camada de células, com processo de endomitose ao longo do desenvolvimento larval, o que promove a replicação do DNA sem divisão celular, ocorrendo então a formação de cromossomos politênicos. Associado ao processo de endomitose, ocorre nos cromossomos politênicos das glândulas salivares de Psl. hygida a abertura de pufes de DNA. Esses constituem segmentos cromossomais específicos na qual ocorre o processo de replicação gênica adicional em diferentes segmentos do genoma. Inúmeros estudos apontam que a formação de pufes de DNA pode estar relacionada com a expressão de proteínas especificas em curtos períodos, necessárias para a evolução dos estágios de vida do organismo. Desta forma, é exequível a realização de estudos no período que ocorre a amplificação gênica e a formação destes pufes de DNA em Psl. hygida, sendo que pode vir a ser chave na elucidação de diversos processos moleculares envolvendo a Ordem Insecta e Família Sciaridae, tais como a transcrição de RNAs e síntese de peptídeos especiais na fase final do desenvolvimento larval. O processo de amplificação gênica nas glândulas salivares de Psl. Hygida vem sendo analisado, com o objetivo de compreender e elucidar a maquinaria metabólica envolvida na formação dos pufes de DNA e na síntese em grande escala de algumas proteínas. Dentre tais estudos podem ser citados a análise da expressão da proteína BhC4-1 envolvida na formação do casulo do inseto, exibindo uma expressão abundante no final do 4º instar larval. Seguindo esse contexto a proteína denominada KIN17, descrita através de uma reatividade cruzada com anticorpos monoclonais específicos para a proteína RecA de Escherichia coli, vem sendo descrita como superexpressa em diferentes tecidos em mamíferos, principalmente locais relacionados ao processo de proliferação celular, tais como células tumorais, como é descrito alta taxa de expressão de KIN17 em melanomas. A proteína KIN17 possui domínios bem definidos na espécie Homo sapiens, tais como um motivo de ligação dedo de zinco e uma cauda KOW com dois motivos de ligação SH3-Like in tandem. A superexpressão da proteína KIN17 em tecidos com alta taxa de proliferação celular e a presença de tais sítios de ligação apontam que pode estar vinculada a processos celulares que envolvam ácidos nucleicos, tais como o processo de replicação e o reparo do DNA. Ademais, estudos apontam que a proteína KIN17 pode estar envolvida na ligação e no processamento de RNAs, visto a presença de um sítio de ligação em sua estrutura e a concomitante superexpressão em tecidos com alta taxa replicativa. Além disso, dados mais recentes referentes ao interactoma da proteína apontam a atuação dela no processo de ribogênese e splincing em células de mamíferos. Diante dos dados descritos podemos destacar a visão multifuncional que essa proteína alvo apresenta diante da comunidade científica. Assim, é de grande relevância investigar e contribuir para o esboço científico sobre a KIN17, podendo auxiliar na determinação da sua exata função nos mais diversos seres vivos estudados. A análise da funcionalidade associada à proteína KIN17 ainda é uma grande lacuna científica acerca da compreensão do processo de replicação adicional quando da formação de pufes de DNA em Sciarideos. Sendo assim, o presente estudo procurou mapear a expressão do gene kin17, quando ocorre o processo da amplificação gênica e da formação dos pufes de DNA. Além disso, a relevância de compreender nas glândulas salivares de Psl. hygida a expressão do gene kin17 auxilia na discussão em inúmeros processos celulares, como reparo, replicação do DNA e ribogênese. A partir de dados de transcriptoma da Psl. hygida, obteve-se uma sequência in silico de 1118 pares de bases (pb) do gene kin17. análise da expressão gênica desse gene por RT-qPCR, apresentou expressão constitutiva nas glândulas salivares, sem diferenças estatisticamente significativas entre as idades larvais E1, E5 e E7, ou entre diferentes regiões glandulares. Por outro lado, o gene BhC4-1, utilizado como controle positivo, exibiu expressões elevadas e compatíveis com a presença de abertura dos pufes de DNA nos cromossomos politênicos nas idades E5 e E7. Em tecido gorduroso o gene kin17 não apresentou variação significativa de expressão entre os diferentes estágios larvais, embora o gene BhC4-1 tenha revelado uma expressão inédita e estatisticamente relevante nesse tecido. Durante o desenvolvimento embrionário, kin17 apresentou maior expressão em ovos com 24 horas em comparação aos de 7 dias, sugerindo discussões sobre sua participação no metabolismo no início da embriogênese. A análise evolutiva da proteína KIN17 indicou elevada conservação do domínio "dedo de zinco" entre espécies, evidenciando sua relevância funcional, enquanto o motivo KOW apresentou alta variabilidade. A árvore filogenética sustentou a divergência evolutiva entre Psl. hygida e humanos, com 55% de diferença na sequência da proteína, possivelmente refletindo variações estruturais e funcionais.

Abstract: Pseudolycoriella hygida is an insect belonging to the order Diptera and the family Sciaridae, in which most representatives are small in size and found in humid environments. The main organisms that make up this family have been used in studies involving gene and genome analysis, such as gene amplification, telomere, cell death, and immunological studies. The target insect in this study has a holometabolous development maintained at a controlled temperature of 20ºC, denoting the presence of complete metamorphosis. Psl. hygida exhibits four different instars in its larval stage, delimited by the process of molting through the exchange of its chitinous exoskeleton. Throughout its larval instar, a pair of salivary glands consisting of three different portions, S1, S2, and S3, can be observed. The insect's salivary glands comprise a tissue formed by a single layer of cells, with endomitosis occurring throughout larval development, which promotes DNA replication without cell division, resulting in the formation of polytene chromosomes. Associated with the endomitosis process, DNA puffs open in the polytene chromosomes of the salivary glands of Psl. hygida. These are specific chromosomal segments in which additional gene replication occurs in different segments of the genome. Numerous studies indicate that the formation of DNA puffs may be related to the expression of specific proteins in short periods, necessary for the evolution of the organism's life stages. Thus, it is feasible to conduct studies during the period in which gene amplification and the formation of these DNA puffs occur in Psl. hygida, which may be key to elucidating various molecular processes involving the Insecta order and Sciaridae family, such as RNA transcription and the synthesis of special peptides in the final stage of larval development. The gene amplification process in the salivary glands of Psl. hygida has been analyzed with the aim of understanding and elucidating the metabolic machinery involved in the formation of DNA puffs and the large-scale synthesis of some proteins. Among these studies, we can mention the analysis of the expression of the protein BhC4-1 involved in the formation of the insect cocoon, which is abundantly expressed at the end of the fourth larval instar. Following this context, the protein called KIN17, described through crossreactivity with monoclonal antibodies specific for the RecA protein of Escherichia coli, has been described as overexpressed in different tissues in mammals, mainly in sites related to the cell proliferation process, such as tumor cells, as described by the high expression rate of KIN17 in melanomas. The KIN17 protein has well-defined domains in the species Homo sapiens, such as a zinc finger binding motif and a KOW tail with two SH3-like binding motifs in tandem. The overexpression of the KIN17 protein in tissues with high cell proliferation rates and the presence of such binding sites suggest that it may be linked to cellular processes involving nucleic acids, such as DNA replication and repair. Furthermore, studies indicate that the KIN17 protein may be involved in RNA binding and processing, given the presence of a binding site in its structure and its concomitant overexpression in tissues with high replication rates. In addition, more recent data on the protein's interactome point to its role in ribogenesis and splincing in mammalian cells. Given the data described above, we can highlight the multifunctional view that this target protein presents to the scientific community. Thus, it is of great importance to investigate and contribute to the scientific outline of KIN17, which may help determine its exact function in the most diverse living beings studied. The analysis of the functionality associated with the KIN17 protein is still a major scientific gap in the understanding of the additional replication process during the formation of DNA puffs in Sciaridae. Therefore, the present study sought to map the expression of the kin17 gene during the process of gene amplification and DNA puff formation. In addition, understanding the kin17 gene expression in the salivary glands of Psl. hygida helps in the discussion of numerous cellular processes, such as repair, DNA replication, and ribogenesis that occur in these polygenic cells. An in silico sequence of 1118 base pairs (bp) of the kin17 gene was obtained from transcriptome data of Psl. hygida. Analysis of kin17 gene expression by RT-qPCR revealed constitutive expression in the salivary glands, with no statistically significant differences observed between larval ages E1, E5, and E7, or between different glandular regions. Conversely, the BhC4-1 gene, which was used as a positive control, exhibited high expression levels consistent with the presence of DNA puffs opening in polytene chromosomes at E5 and E7 stages. In other analysed tissues, KIN17 did not exhibit significant variation in expression in the fat body across different larval stages. However, the BhC4-1 gene demonstrated unprecedented and statistically significant expression in this tissue. During embryonic development, KIN17 showed higher expression in 24- hour-old eggs than in 7-day-old eggs, suggesting a role in early embryogenesis metabolism. Evolutionary analysis of the KIN17 protein revealed high conservation of the zinc finger domain across species, emphasising its functional importance, whereas the KOW motif exhibited significant variability. The phylogenetic tree revealed a 55% difference in protein sequence between Psl. hygida and humans, suggesting evolutionary divergence and potential structural and functional variations.