Do mecanismo de ação à entrega intracelular : dupla estratégia do uso de bitiofeno contra Trypanosoma cruzi

Abstract

RESUMO: A doença de Chagas (DC), também conhecida como tripanossomíase americana, foi descoberta e descrita pelo médico sanitarista e cientista brasileiro Carlos Chagas em 1909. É causada pelo Trypanosoma cruzi, um protozoário parasito uniflagelado que apresenta três principais formas ao longo de seu ciclo de vida: a forma epimastigota (replicativa extracelular, não infectiva - presente no tubo digestivo do inseto vetor), a forma tripomastigota (não replicativa, infectiva - presente nas porções finais do intestino do inseto e na corrente sanguínea de mamíferos infectados) e a forma amastigota (replicativa intracelular, infectiva - presente no interior das células infectadas). O ciclo de vida deste protozoário é complexo, alternando entre um hospedeiro vertebrado (mamífero) e um invertebrado (triatomíneo), caracterizando-se também como heteroxênico. A doença de Chagas apresenta curso clínico variável, dividido em três principais fases: aguda, indeterminada e crônica. A fase aguda é inicial, de rápida evolução, com elevada parasitemia. Corresponde à fase de infecção e disseminação do parasito no organismo, com duração média de 4 a 12 semanas. Pode ser assintomática ou apresentar alguns sinais e sintomas, que variam em frequência e intensidade. A fase indeterminada, geralmente assintomática, pode se estender por vários anos sem manifestações clínicas evidentes. A fase crônica ocorre em cerca de 30 a 40% dos pacientes e caracteriza-se por uma resposta inflamatória contínua, que compromete órgãos como o coração e o trato gastrointestinal. A evolução clínica da doença depende de diversos fatores, incluindo as características do hospedeiro e a cepa infectante de T. cruzi. O tratamento atual baseia-se em dois fármacos desenvolvidos há mais de 50 anos: benznidazol e nifurtimox. Ambos apresentam perfis farmacológicos semelhantes, com alta eficácia somente na fase aguda e elevada toxicidade. Dessa forma, há uma demanda urgente por novas alternativas terapêuticas, principalmente para a fase crônica da doença. Neste contexto, e com base em estudos prévios que demonstraram a eficácia de moléculas bitiofênicas contra tripanossomatídeos, o presente trabalho teve como objetivo a síntese de um novo derivado bitiofênico (BTAc), seguido da avaliação de sua atividade antiparasitária frente às três formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas), da investigação dos mecanismos de morte celular induzidos por essa molécula e do desenvolvimento de um sistema de liberação controlada por meio de polimerossomos. A síntese de BTAc foi realizada por reação de acoplamento, com rendimento de 90%. A substância foi avaliada in vitro quanto à sua atividade antiproliferativa em epimastigotas e amastigotas, e sua capacidade lítica sobre tripomastigotas. A citotoxicidade foi investigada em células LLCMK2 e hemácias. Os resultados mostraram atividade significativa frente às três formas evolutivas, com valores de CI50 de 46,37 ?M (epimastigotas), 75,98 ?M (tripomastigotas) e 115,19 ?M (amastigotas), e CC50 de 573,04 ?M, gerando índices de seletividade superiores a 1. Além disso, os efeitos de CI50 sobre os parasitos foram analisados considerando múltiplos tempos de exposição, explorando as alterações morfológicas e ultraestruturais, o potencial desequilíbrio oxidativo, e o desencadeamento das diferentes vias de morte celular. Inicialmente estudos de morfologia e ultraestrutura por microscopia eletrônica revelaram alterações significativas, como danos na membrana plasmática, mitocôndrias e núcleo, além da presença de vacúolos e acúmulo de corpos lipídicos, posteriormente confirmados por fluorimetria. Análises por citometria de fluxo demonstraram aumento do tamanho celular em tripomastigotas e redução em epimastigotas e amastigotas. Ensaios bioquímicos mostraram aumento de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e peroxidação lipídica, além de despolarização mitocondrial. A exposição de fosfatidilserina nas três formas indicou predominância de morte por apoptose, com indícios adicionais de necrose (em amastigotas) e autofagia (em tripomastigotas), sugerindo que BTAc pode induzir múltiplas vias de morte celular no parasito. Considerando a moderada hidrofobicidade de BTAc, a substância foi encapsulada em polimerossomos (PS) de PEG17-b-PPS30 com objetivo de otimizar sua atividade antiparasitária, reduzir efeitos adversos e modular a resposta imune. Os PS são vesículas nanométricas que apresentam caráter anfifílicos, carregando o poder de carrear substâncias tanto hidrofóbicas quanto hidrofílicas. Os PS foram produzidos com sucesso, e apresentaram propriedades físico-químicas adequadas (tamanho médio de 120 nm, baixa polidispersão e eficiência de encapsulação de ~34%). A forma nanoencapsulada (BTAc-PS) demonstrou eficácia superior à forma não encapsulada, contra amastigotas intracelulares de três cepas distintas de T. cruzi: CL Brener, Brazil e Y, com valores de CI50 de 6,17; 24,01 e 30,68 ?g/mL, respectivamente. A internalização e liberação intracelular dos PS foram confirmadas por Förster Ressonance Energy Transfer (FRET) que evidenciou a captação das nanopartículas por macrófagos RAW 264.7 nas primeiras 24 h, e posterior escape endossomal e liberação de carga no citosol, local onde os parasitos intracelulares replicativos residem no hospedeiro mamífero. Por fim, tanto BTAc não encapsulado quanto BTAc-PS apresentaram atividade anti-inflamatória in vitro, com redução significativa de citocinas pró-inflamatórias como TNF-?, IFN-? e IL-6. Em conclusão, este trabalho demonstrou o potencial de um novo derivado bitiofênico como candidato a fármaco contra T. cruzi, evidenciando atividade antiparasitária, entrega intracelular eficiente e capacidade de modular a resposta inflamatória, sugerindo sua aplicabilidade em estratégias terapêuticas para pacientes na fase crônica da doença de Chagas

ABSTRACT: Chagas disease (CD), also known as American trypanosomiasis, was discovered and described by Carlos Chagas in 1909. It is caused by Trypanosoma cruzi, a uniflagellated parasitic protozoan that exhibits different morphological forms throughout its life cycle. These include the epimastigote form (a non-infective, extracellular, replicative stage found in the digestive tract of the insect vector), the trypomastigote form (a non-replicative, infective stage present in the terminal portions of the insect's intestine and in the bloodstream of infected mammals), and the amastigote form (an intracellular, replicative, infective stage found within infected host cells). The life cycle of this protozoan is complex, alternating between a vertebrate host (mammal) and an invertebrate vector (triatomine insect), and is thus characterized as heteroxenous. CD has a variable clinical course, progressing through acute, indeterminate, and chronic. The acute phase is the initial stage, with rapid progression and high parasitemia. It corresponds to the phase of infection and dissemination of the parasite throughout the organism, with an average duration of 4 to 12 weeks. It may be asymptomatic or present some signs and symptoms, which vary in frequency and intensity. The indeterminate phase, usually asymptomatic, can last for several years without evident clinical manifestations. The chronic phase occurs in about 30 to 40% of patients and is characterized by a continuous inflammatory response, which affects organs such as the heart and the gastrointestinal tract. The clinical progression of the disease depends on several factors, including host characteristics and the infecting T. cruzi strain. Current treatment relies on two drugs developed over 50 years ago: benznidazole and nifurtimox. However, both exhibits very similar profiles, with high efficacy limited to the acute phase and significant toxicity. Therefore, there is an urgent need for new therapeutic alternatives, especially for the chronic phase of the disease. In this context, and based on previous studies that demonstrated the efficacy of bithiophene molecules against trypanosomatids, the present study aimed to synthesize a new bithiophene derivative (BTAc), followed by the evaluation of its antiparasitic activity against the three evolutionary forms of T. cruzi (epimastigotes, trypomastigotes, and amastigotes), the investigation of the mechanisms of cell death induced by this molecule, and the development of a nano-system using polymersomes. The synthesis of BTAc was carried out through a coupling reaction, with a 90% yield. The compound was evaluated in vitro for its antiproliferative activity against epimastigotes and amastigotes, as well as its lytic capacity against trypomastigotes. Cytotoxicity was assessed in LLCMK2 cells and red blood cells. The results demonstrated significant activity against all three parasite forms, with IC?? values of 46.37 ?M (epimastigotes), 75.98 ?M (trypomastigotes), and 115.19 ?M (amastigotes), and a CC?? of 573.04 ?M, resulting in good selectivity indices. Additionally, IC50 or EC50 values were used to treat parasites to analyze ultrastructural and morphological changes by electron microscopy, as well as biochemical assays to investigate oxidative balance and death pathways. Morphological and ultrastructural studies initially revealed significant alterations, including plasma membrane, mitochondrial, and nuclear damage, as well as the presence of vacuoles and lipid body accumulation, later confirmed by fluorimetry. Flow cytometry analyses showed an increased cell size in trypomastigotes and reduced size in epimastigotes and amastigotes. Biochemical assays demonstrated increased levels of reactive oxygen and nitrogen species, lipid peroxidation, and mitochondrial depolarization. Phosphatidylserine exposure in all three forms indicated predominant apoptotic cell death, with additional signs of necrosis (in amastigotes) and autophagy (in trypomastigotes), suggesting that BTAc can trigger multiple parasite death pathways. Given the moderate hydrophobicity of BTAc, the compound was encapsulated in PEG17-b-PPS30 polymersomes (PS) to optimize antiparasitic activity, reduce side effects, and modulate immune response. PS are nanometric vesicles with amphiphilic properties capable of carrying both hydrophobic and hydrophilic substances. The PS were successfully produced and exhibited suitable physicochemical properties (mean size of 120 nm, low polydispersity, and ~34% encapsulation efficiency). The nanoencapsulated form (BTAc-PS) showed superior efficacy compared to the free form against intracellular amastigotes from three distinct T. cruzi strains: CL Brener, Brazil, and Y, with IC50 values of 6.17, 24.01, and 30.68 ?g/mL, respectively. Internalization and intracellular release of PS were confirmed by Förster Resonance Energy Transfer (FRET), which evidenced nanoparticle uptake by RAW 264.7 macrophages within 24 h, followed by endosomal escape and cytosolic release, the site where replicative intracellular parasites reside in the mammalian host. Finally, both free and encapsulated BTAc exhibited in vitro anti-inflammatory activity, with significant reductions in proinflammatory cytokines such as TNF-?, IFN-?, and IL-6. In conclusion, this study demonstrated the potential of a novel bithiophene derivative as a drug candidate against T. cruzi, highlighting its antiparasitic activity, efficient intracellular delivery, and ability to modulate inflammatory responses, suggesting its applicability in therapeutic strategies for patients in the chronic phase of Chagas disease