Atividade antiprotozoário e estudos de mecanismos de ação e derivados de benzohidrazonas em Leishimania amazonensis e Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo: As doenças negligenciadas compõem um grupo de enfermidades infecciosas prevalentes em países em desenvolvimento. Por atingirem populações mais pobres, não oferecem um mercado lucrativo para a indústria farmacêutica, o que representa uma barreira no desenvolvimento de terapias mais eficazes e seguras. Entres as principais doenças tropicais negligenciadas estão a leishmaniose e a doença de Chagas, causadas pelos tripanossomatídeos Leishmania sp e Trypanosoma cruzi, respectivamente. Por pertencerem à mesma família, ambos os protozoários possuem semelhanças estruturais, como uma única mitocôndria que se estende pelo corpo celular, DNA mitocondrial organizado no cinetoplasto, presença de flagelos, microtúbulos subpeliculares e reservossomos. Os protozoários do gênero Leishmania possuem duas entidades morfológicas principais durante o ciclo de vida: promastigotas e amastigotas. Os amastigotas consistem em formas esféricas ou ovais que se multiplicam dentro das células do sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro vertebrado. As fêmeas de flebotomíneos, ao se alimentarem do sangue do animal contaminado, ingerem os macrófagos infectados e, então, no trato digestivo do inseto, as formas amastigotas se diferenciam em promastigotas. Estas, por sua vez, migram para a probóscide do inseto, onde podem ser inoculadas durante a hematofagia e infectar novos vertebrados. O ciclo de vida do T. cruzi é complexo e envolve três entidades morfológicas que se diferenciam pela posição do cinetoplasto em relação ao núcleo celular: epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas. Ao se alimentar do sangue de mamíferos infectados, o triatomíneo adquire tripomastigotas sanguíneas, que no intestino do inseto se transformam em epimastigotas replicativos. Estes se multiplicam por fissão binária e migram para o reto, onde se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, a forma infectiva do parasito. Por sua vez, as tripomastigotas liberadas junto com as excretas do vetor podem penetrar em lacerações na pele, mucosa ou conjuntiva do hospedeiro vertebrado e invadir diferentes células nucleadas, onde se diferenciam em amastigotas, se multiplicam e se diferenciam em tripomastigotas sanguíneas, que são liberados podendo infectar novas células. Ambas as doenças se caracterizam como enfermidades parasitárias graves, endêmicas em regiões tropicais e subtropicais. A leishmaniose pode se manifestar nas formas cutânea, mucocutânea e visceral, sendo esta última a mais grave, com comprometimento de órgãos internos como baço, fígado e medula óssea, e alta letalidade na ausência de tratamento. Embora não letal, a forma cutânea da leishmaniose também representa um importante problema de saúde pública, devido às lesões ulceradas crônicas e desfigurantes que podem comprometer significativamente a qualidade de vida dos pacientes. Já a doença de Chagas apresenta evolução crônica e silenciosa, com risco elevado de complicações cardíacas ou digestivas, caracterizadas por miocardiopatia chagásica, megacólon e megaesôfago. Diante da gravidade destas doenças e da carência de tratamento totalmente efetivos, torna-se necessário e urgente o desenvolvimento de novos medicamentos capazes de oferecer maior qualidade de vida e proporcionar a cura para a população infectada. Os efeitos adversos provocados pelos medicamentos utilizadas e os longos tratamentos também representam uma barreira na terapia destas doenças, pois leva ao abandono do tratamento. Isso, somado a resistência desenvolvida aos fármacos padrões, tem levado a busca de novos compostos naturais e sintéticos com atividade antiproliferativa nos tripanossomatídeos causadores destas enfermidades. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade de novos compostos sintéticos derivados de N-acil-hidrazonas e 1,3,4-oxadiazois em L. amazonensis, além de caracterizar o modo de ação do derivado de benzohidrazona BH6, (E)-N'-(tiofen-2-ilmetileno)benzoidrazida, em promastigotas de L. amazonensis e de BH6 e BH7, (E)-N'-((5-nitrofuran-2-il)metileno)benzoidrazida), em epimastigotas, amastigotas e tripomastigotas de T. cruzi. A atividade antiproliferativa dos 32 compostos foi avaliada pela redução do XTT e a citotoxicidade em J774.A1 pela redução do MTT. Os efeitos de BH6 e BH7 na morfologia e ultraestrutura dos parasitos foram observados por meio de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão, respectivamente. Ensaios fluorimétricos e de citometria de fluxo foram realizados para determinação da produção de EROs, peroxidação lipídica, produção de óxido nítrico, níveis de inclusões lipídicas, potencial de membrana mitocondrial, níveis intracelulares de ATP, integridade da membrana plasmática, vesículas ácidas, vacúolos autofágicos e análise do ciclo celular. As benzohidrazonas BH6 e BH7 apresentaram atividade antiproliferativa em epimastigotas de T. cruzi (IC50 de 4,72 ± 0,47 ?M e 4,85 ± 0,57 ?M, respectivamente) e promastigotas de L. amazonensis (BH6 IC50 de 7,18 ± 1,0 ?M). Ademais, os compostos BH6 e BH7 demonstraram atividade em amastigotas (IC50 20,36 ± 4,16 ?M e IC50 20,41 ± 1,46 ?M, respectivamente) e em tripomastigotas de T. cruzi (EC50 22,01 ± 4,16 ?M e EC50 18,41 ± 2,94 ?M, respectivamente). Alterações morfológicas semelhantes foram observadas para todos os tratamentos, como arredondamento celular e enrugamento da membrana plasmática. Além disso, BH6 e BH7 provocaram alterações ultraestruturais, como inchaço mitocondrial e a presença de membranas concêntricas no interior da mitocôndria e no citoplasma, em todos os parasitos testados. Devido à similaridade entre os dois compostos, que diferem apenas por um heteroátomo no anel de cinco membros e em um substituinte, os ensaios bioquímicos demonstraram resultados semelhantes para os dois compostos. Em L. amazonensis, os efeitos de BH6 estavam associadas à disfunção mitocondrial, incluindo despolarização da membrana e depleção de ATP, bem como ao aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio. As análises bioquímicas revelaram níveis elevados de peroxidação lipídica e acúmulo de lipídios intracelulares, sugerindo alterações na dinâmica de membrana. Em T. cruzi, as benzohidrazonas ocasionaram os compostos promoveram a despolarização da membrana mitocondrial e depleção dos níveis intracelulares de ATP em epimastigotas e amastigotas. As substâncias induziram um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), levando a peroxidação lipídica em epimastigotas e amastigotas. Formas epimastigotas apresentaram redução nos níveis de óxido nítrico, provavelmente em decorrência da degradação pelo excesso de ERO. Em amastigotas, os níveis de óxido nítrico aumentaram em ambos os tratamentos com IC90, indicando um desbalanço nas espécies reativas de nitrogênio. Os efeitos de BH6 e BH7 foram mais sutis em tripomastigotas. Além disso, os compostos ocasionaram parada do ciclo celular na fase G0/G1 em epimastigotas. Em conjunto, os resultados obtidos demonstram que os derivados de benzohidrazona BH6 e BH7 apresentam atividade antiparasitária promissora frente a diferentes formas evolutivas de L. amazonensis e T. cruzi. Ambos os compostos interferiram em estruturas e processos biológicos essenciais à sobrevivência dos tripanossomatídeos, especialmente aqueles relacionados à integridade mitocondrial e ao metabolismo oxidativo. As alterações morfológicas e bioquímicas observadas indicam que BH6 e BH7 induzem um desbalanço redox e disfunção mitocondrial. Esses achados reforçam o potencial dessas benzohidrazonas como moléculas bioativas candidatas ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra doenças tropicais negligenciadas como a leishmaniose e a doença de Chagas.

Abstract: Neglected diseases are a group of infectious diseases prevalent in developing countries. Because they affect the poorest populations, they do not offer a lucrative market for the pharmaceutical industry, which represents a barrier to the development of more effective and safer therapies. Among the major neglected tropical diseases are Leishmaniasis and Chagas disease, caused by the trypanosomatids Leishmania sp and Trypanosoma cruzi, respectively. Because they belong to the same family, both protozoa have structural similarities, such as a single mitochondrion extending through the cell body, mitochondrial DNA organized in the kinetoplast, the presence of flagella, subpellicular microtubules and reservosomes. The protozoa of the Leishmania genus have two main morphological entities during their life cycle: promastigotes and amastigotes. The amastigotes consist of spherical or oval forms that multiply inside the cells of the vertebrate host's mononuclear phagocytic system. Female phlebotomine sandflies, when feeding on the blood of a contaminated animal, ingest the infected macrophages and then, in the insect's digestive tract, the amastigote forms differentiate into promastigotes. These, in turn, migrate to the insect's proboscis, where they can be inoculated during hematophagy and infect new vertebrates. The life cycle of T. cruzi is complex and involves three morphological entities which are differentiated by the position of the kinetoplast in relation to the cell nucleus: epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes. When feeding on the blood of infected mammals, the triatomine acquires blood-borne trypomastigotes, which transform in the insect's intestine into replicative epimastigotes. These multiply by binary fission and migrate to the rectum, where they differentiate into metacyclic trypomastigotes, the infective form of the parasite. In turn, the trypomastigotes released along with the vector's excreta can penetrate lacerations in the skin, mucosa or conjunctiva of the vertebrate host and invade different nucleated cells, where they differentiate into amastigotes, multiply and differentiate into blood trypomastigotes, which are released and can infect new cells. Both diseases are characterized as serious parasitic diseases, endemic in tropical and subtropical regions. Leishmaniasis can manifest itself in cutaneous, mucocutaneous and visceral forms, the latter being the most serious, with involvement of internal organs such as the spleen, liver and bone marrow, and high lethality in the absence of treatment. Although not lethal, the cutaneous form of leishmaniasis also represents an important public health problem, due to the chronic and disfiguring ulcerated lesions that can significantly compromise patients' quality of life. Chagas' disease, on the other hand, has a chronic and silent evolution, with a high risk of cardiac or digestive complications, characterized by Chagas' cardiomyopathy, megacolon and megaesophagus. Given the severity of these diseases and the lack of fully effective treatments, the development of new drugs capable of offering a better quality of life and a cure for the infected population becomes necessary and urgent. The various adverse effects caused by the drugs used and the long treatments also represent a barrier in the therapy of these diseases, because it leads to treatment abandonment. This, added to the resistance developed to standard drugs, has led to the search for new natural and synthetic compounds with antiproliferative activity in trypanosomatids that cause these diseases. Thus, the present work aimed to evaluate the activity of new synthetic compounds derived from N-acylhydrazones and 1,3,4-oxadiazois on L. amazonensis, as well as characterizing the mode of action of the benzohydrazone derivative BH6, (E)-N'-(thiophen-2-ylmethylene)benzohydrazide, on L. amazonensis promastigotes and of BH6 and BH7, (E)-N'-((5-nitrofuran-2-yl)methylene)benzohydrazide), on T. cruzi epimastigotes, amastigotes and trypomastigotes. The antiproliferative activity of the 32 compounds was evaluated by the reduction of XTT and cytotoxicity in J774.A1 by the reduction of MTT. The effects of BH6 and BH7 on parasite morphology and ultrastructure were observed using scanning and transmission electron microscopy, respectively. Fluorimetric and flow cytometry assays were carried out to determine ROS production, lipid peroxidation, nitric oxide production, levels of lipid inclusions, mitochondrial membrane potential, intracellular ATP levels, plasma membrane integrity, acidic vesicles, autophagic vacuoles and cell cycle analysis. Benzohydrazones BH6 and BH7 showed antiproliferative activity in T. cruzi epimastigotes (IC50 of 4.72 ± 0.47 ?M and 4.85 ± 0.57 ?M, respectively) and L. amazonensis promastigotes (BH6 IC50 of 7.18 ± 1.0 ?M). In addition, compounds BH6 and BH7 showed activity in amastigotes (IC50 20.36 ± 4.16 ?M and IC50 20.41 ± 1.46 ?M, respectively) and in trypomastigotes of T. cruzi (EC50 22.01 ± 4.16 ?M and EC50 18.41 ± 2.94 ?M, respectively). Similar morphological changes were observed for all treatments, such as cell rounding and shrinkage of the plasma membrane. In addition, BH6 and BH7 caused ultrastructural changes, such as mitochondrial swelling and the presence of concentric membranes inside the mitochondria and cytoplasm, in all treated parasites. Due to the similarity between the two compounds, which differ only by one heteroatom in the five-membered ring and in one substituent, biochemical assays showed similar results for the two compounds. In L. amazonensis, the effects of BH6 were associated with mitochondrial dysfunction, including membrane depolarization and ATP depletion, as well as increased production of reactive oxygen and nitrogen species. Biochemical analyses revealed high levels of lipid peroxidation and intracellular lipid accumulation, suggesting alterations in membrane dynamics. In T. cruzi, benzohydrazones caused mitochondrial membrane depolarization and depletion of intracellular ATP levels in epimastigotes and amastigotes. The substances induced an increase in the production of reactive oxygen species (ROS), leading to lipid peroxidation in epimastigotes and amastigotes. Epimastigote forms showed a reduction in nitric oxide levels, probably due to degradation by excess ROS. In amastigotes, nitric oxide levels increased in both IC90 treatments, indicating an imbalance in reactive nitrogen species. The effects of BH6 and BH7 were more subtle in trypomastigotes. In addition, the compounds caused cell cycle arrest in the G0/G1 phase in epimastigotes. Therefore, the results show that the benzohydrazone derivatives BH6 and BH7 have promising antiparasitic activity against different evolutionary forms of L. amazonensis and T. cruzi. Both compounds interfered with structures and biological processes essential to the survival of trypanosomatids, especially those related to mitochondrial integrity and oxidative metabolism. The morphological and biochemical changes observed indicate that BH6 and BH7 induce a redox imbalance and mitochondrial dysfunction. These findings reinforce the potential of these benzohydrazones as candidate bioactive molecules for the development of new therapeutic strategies against neglected tropical diseases such as leishmaniasis and Chagas disease.