Análise histológica do tecido hepático e dos aspectos reprodutivos nas espécies Astyanax lacustris e Danio rerio submetidos a exposiçõa crônica de metformina

Abstract

Resumo: A metformina é um fármaco amplamente utilizado no tratamento do diabetes tipo 2, sendo frequentemente detectado em ambientes aquáticos devido à sua baixa metabolização pelo organismo humano e à ineficiência dos sistemas convencionais de tratamento de esgoto, de forma que o medicamento chegue de forma inalterada no meio ambiente aquático. Embora sua eficácia farmacêutica em humanos seja de grande relevância, esse composto tem sido classificado como um contaminante emergente de preocupação crescente, especialmente pelos possíveis efeitos adversos ao alcançar o meio aquático que pode causar em organismos não-alvo, como os peixes. Estudos vêm demonstrando que a exposição crônica à metformina pode desencadear alterações em diferentes níveis biológicos, afetando desde estruturas celulares até aspectos fisiológicos complexos, como a reprodução. Diante desse cenário, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica à metformina em duas espécies de peixes: Danio rerio, um organismo modelo amplamente utilizado em estudos toxicológicos, e Astyanax lacustris, uma espécie neotropical como um potencial bioindicador. Os experimentos envolveram a exposição dos animais de ambos os sexos, distribuídos de forma randomizada em a quatro concentrações de metformina, além do controle (50, 100, 150 e 10.000?g/L) por um período de 90 dias, com posterior avaliação de parâmetros histológicos e morfométricos do fígado, além de parâmetros de medidas corporais e reprodutivos. No que diz respeito aos efeitos hepáticos, D. rerio apresentou alterações progressivas e dose-dependentes, com aumento significativo na ocorrência de hepatócitos vacuolizados, necrose, congestão e desorganização da arquitetura hepática, especialmente nas concentrações mais altas. O índice hepatossomático (IHS) indicou comprometimento moderado a severo da função hepática em 150 e 10.000?g/L, corroborado pelos dados morfométricos que apontaram aumento da área e da frequência de hepatócitos vacuolizados. Em contraste, A. lacustris demonstrou uma resposta menos intensa, embora também tenha apresentado alterações hepáticas relevantes, com maior resistência fisiológica aparente, mas ainda com indícios de comprometimento celular nas concentrações elevadas. Quanto aos parâmetros corporais e reprodutivos, os efeitos da metformina variaram entre as espécies e entre os sexos. Em D. rerio, as fêmeas expostas a 150 e 10.000?g/L apresentaram redução significativa no comprimento total dos peixes, enquanto nos machos expostos a menor concentração (50?g/L) foi suficiente para provocar redução nos tamanhos. Em espécimes de A. lacustris, não houve alterações significativas em seu comprimento total, mas o peso foi reduzido nos grupos expostos as concentrações de 50 e 10.000?g/L de metformina, com resposta distinta entre machos e fêmeas. Avaliação do fator de condição alométrico (Ka), que consiste em uma medida utilizada para avaliar a condição corporal de peixes, não apresentou diferenças significativas, mas observou-se um padrão compensatório em algumas concentrações, principalmente nas fêmeas, sugerindo uma possível redistribuição energética diante do estresse induzido, ou seja, na realocação do estoque de energia. O índice gonadossomático (IGS) revelou-se um marcador sensível aos efeitos reprodutivos da metformina. Em D. rerio, os machos apresentaram redução significativa do IGS em todas as concentrações testadas, enquanto as fêmeas apresentaram aumento do índice até 150?g/L, com leve queda na maior concentração. Em A. lacustris, observou-se queda expressiva do IGS nas fêmeas expostas à concentração de 10.000?g/L e em todos os grupos de machos. Essas alterações indicam que a metformina pode interferir na dinâmica gonadal, comprometendo a maturação sexual, principalmente nos machos. Análise dos ovários reforçaram essa tendência. Em A. lacustris, observou-se que os ovários de fêmeas expostas às concentrações intermediárias (100 e 150?g/L) apresentavam morfologia compatível com maturação avançada, com predomínio de ovócitos vitelogênicos tardios, vasos calibrosos e presença de folículos pós-ovulatórios, indicando aptidão para desova. Por outro lado, nas concentrações de 50 e 10.000?g/L, os ovários se mantiveram em estágios iniciais de desenvolvimento, com predominância de ovócitos imaturos. O diâmetro ovocitário acompanhou essa tendência, sendo maior nos grupos com predomínio de ovócitos maduros e menor nos grupos com desenvolvimento ovariano retardado. Esses resultados indicam que a metformina atua como um desregulador endócrino, afetando negativamente a fisiologia reprodutiva e hepática dos peixes, mesmo em concentrações compatíveis com aquelas detectadas em ambientes aquáticos. Os efeitos observados foram espécie-específicos e sexo-específicos, ou seja, os espécimes de D. rerio mostrando maior sensibilidade hepática e A. lacustris respondendo de forma mais evidente em parâmetros reprodutivos. As alterações reprodutivas observadas nas fêmeas e a sensibilidade dos machos em baixas concentrações reforçam a importância de se considerar múltiplos parâmetros e organismos bioindicadores em avaliações ecotoxicológicas. Dessa forma, os achados do presente estudo contribuíram para a compreensão dos impactos subletais da metformina em duas espécies distintas de peixes, evidenciando riscos à saúde populacional dos mesmos e, potencialmente, à estrutura dos ecossistemas onde esse contaminante está presente.

Abstract: Metformin is a pharmaceutical widely prescribed for the treatment of type 2 diabetes and is frequently detected in aquatic environments due to its low rate of human metabolism and the inefficiency of conventional wastewater treatment systems. Although considered to exhibit low toxicity in humans, metformin has been classified as an emerging contaminant of increasing concern, particularly because of its potential adverse effects on non-target aquatic organisms such as fish. Recent studies have demonstrated that chronic exposure to this compound can lead to a range of biological alterations, from cellular damage to disruptions in complex physiological processes, including reproduction. In this context, the present study aimed to investigate the effects of chronic exposure to metformin on two fish species: Danio rerio, a well-established model organism in toxicological research, and Astyanax lacustris, a neotropical species proposed as a potential bioindicator. Experimental exposures were conducted over a 90-day period using four environmentally relevant and high concentrations of metformin (50, 100, 150, and 10.000?g/L). After the exposure period, hepatic histological and morphometric parameters were evaluated, along with somatic and reproductive endpoints. Regarding hepatic effects, D. rerio exhibited progressive, dose-dependent alterations, including a significant increase in the incidence of vacuolated hepatocytes, necrosis, vascular congestion, and disorganization of hepatic architecture, particularly at higher concentrations. The hepatosomatic index (HSI) revealed moderate to severe impairment of liver function at 150 and 10.000?g/L, which was further supported by morphometric data showing increased area and frequency of vacuolated hepatocytes. In contrast, A. lacustris showed a comparatively milder hepatic response, although relevant alterations were also observed, suggesting greater physiological resilience yet with signs of cellular damage at the highest exposure levels. With respect to somatic and reproductive parameters, metformin-induced effects varied between species and sexes. In D. rerio, females exposed to 150 and 10.000?g/L showed significant reductions in body length, while in males, even the lowest tested concentration (50?g/L) resulted in decreased growth. In A. lacustris, no statistically significant differences were observed in length; however, body weight was reduced in fish exposed to 50 and 10.000?g/L, with sex-specific differences in response. The condition factor (K) did not show significant alterations overall, although some evidence of compensatory physiological responses was observed at specific concentrations, especially in females, suggesting potential energy reallocation under chemical stress. The gonadosomatic index (GSI) emerged as a sensitive indicator of metformin's reproductive effects. In D. rerio, males exhibited significant GSI reductions at all tested concentrations, while females presented increased GSI values up to 150?g/L, followed by a slight decrease at 10.000?g/L. In A. lacustris, a pronounced GSI reduction was observed in females exposed to 10.000?g/L and across all male groups, indicating potential impairment in gonadal development and function, particularly in males. Ovarian histology reinforced these findings. In A. lacustris, females exposed to intermediate concentrations (100 and 150?g/L) displayed ovaries with advanced maturation features, such as a predominance of late vitellogenic oocytes, well-developed blood vessels, and the presence of post-ovulatory follicles, suggesting reproductive readiness. In contrast, ovaries from females exposed to 50 and 10.000?g/L remained in early stages of development, with a predominance of immature oocytes. Oocyte diameter followed the same pattern, being larger in mature ovarian profiles and reduced in groups with delayed ovarian development. Overall, the results indicate that metformin acts as an endocrine disruptor, adversely affecting both hepatic and reproductive physiology in fish, even at concentrations comparable to those detected in natural aquatic environments. The observed effects were both species- and sex-specific, with D. rerio exhibiting greater hepatic sensitivity and A. lacustris showing more pronounced reproductive disruption. The reproductive alterations in females and high sensitivity in males at low concentrations underscore the need for comprehensive ecotoxicological evaluations that consider multiple biological endpoints and representative bioindicator species. These findings contribute to the understanding of the sublethal effects of metformin in two fish species and raise concerns regarding the potential ecological risks associated with the continuous release of pharmaceutical contaminants into freshwater ecosystems.