Regulação da enzima Glutamina sintetase de Herbaspirillum seropedicae em resposta ao balanço carbono-nitrogênio : aspectos funcionais e estruturais

Abstract

Resumo: O processo de assimilação de amônio consiste na aminação do 2-oxoglutarato para formar glutamato. Em bactérias, durante a limitação de nitrogênio, a via preferencial de assimilação de amônio é a via GS-GOGAT, na qual a enzima GS catalisa a aminação do glutamato e a enzima GOGAT catalisa a transaminação do 2-oxoglutarato, formando duas moléculas de glutamato. O ciclo GS-GOGAT é responsável, portanto, pela manutenção da homeostase de aminoácidos na célula. A reação da GS consome energia na forma de ATP. Considerando a demanda de energia para a catálise e a importância do ciclo GS-GOGAT para a homeostase do metabolismo de nitrogênio, a enzima GS é estritamente regulada. Um dos principais mecanismos de regulação de GS é a modificação pós-traducional por adenililação catalisada pela enzima bifuncional GlnE. Em altas concentrações de nitrogênio intracelular, GlnE catalisa a adenililação da GS, inibindo a assimilação de amônio. Quando a célula se encontra em condições limitantes de nitrogênio, GlnE remove a modificação da GS, tornando-a ativa. A atividade da GlnE é regulada pela enzima GlnB, que sofre modificação pós-traducional em função da disponibilidade de nitrogênio, sendo uridililada em condições de baixo nitrogênio intracelular. Nesse trabalho, nós mostramos que em Herbaspirillum seropedicae, GlnB uridililada é responsável por inibir a atividade adenilil-transferase da GlnE, enquanto a GlnB não modificada não influencia na atividade. Além disso, mostramos que a condição de alto nitrogênio é diretamente integrada pela GlnE via regulação por glutamina. Nós também propomos um mecanismo de sensibilidade a glutamina a nível molecular pela resolução inicial da estrutura do domínio C-terminal da GlnE por cristalografia por difração de raios-X. Ainda, mostramos qual o efeito da adenililação da GS a nível estrutural pela resolução de três estruturas da enzima GS por criomicroscopia eletrônica.

Abstract: The process of ammonium assimilation consists of the amination of 2-oxoglutarate to synthesize glutamate. In bacteria, under nitrogen-limiting conditions, the preferred pathway for ammonium assimilation is the GS-GOGAT pathway, in which the enzyme GS catalyzes the amination of glutamate and the enzyme GOGAT catalyzes the transamination of 2-oxoglutarate, forming two molecules of glutamate. The GS-GOGAT cycle is therefore responsible for maintaining amino acid homeostasis in the cell. The GS reaction consumes ATP as energy source. Considering the energy demand for catalysis and the importance of the GS-GOGAT cycle for nitrogen metabolism homeostasis, the enzyme GS is strictly regulated. One of the main mechanisms of GS regulation is post-translational modification by adenylylation catalyzed by the bifunctional enzyme GlnE. At high intracellular nitrogen concentration, GlnE catalyzes the adenylylation of GS, inhibiting ammonium assimilation. When the cell is under nitrogen-limiting conditions, GlnE removes this modification from GS, rendering it active. The activity of GlnE is regulated by the enzyme GlnB, which undergoes post-translational modification depending on nitrogen availability, an uridylylation under conditions of low intracellular nitrogen. In this work, we show that in Herbaspirillum seropedicae, uridylylated GlnB is responsible for inhibiting the adenylyltransferase activity of GlnE, whereas unmodified GlnB does not influence this activity. In addition, we show that high-nitrogen conditions are directly integrated by GlnE via regulation by glutamine. We also propose a molecular mechanism for glutamine sensitivity based on the initial resolution of the structure of the C-terminal domain of GlnE by X-ray crystallography. Furthermore, we show the structural effects of GS adenylylation by solving three structures of the GS enzyme using cryo-electron microscopy.