Modelagem farmacocinética e farmacodinâmica da isoniazida em isolados clínicos resistentes e atividade antimicobacteriana de compostos oxadiazólicos

Abstract

RESUMO: O aumento nos casos de resistência aos medicamentos utilizados no tratamento da tuberculose(TB)contribuemdeformageralparaoagravamentodasituaçãoanívelmundial, tornando-se cada vez mais urgente a busca por novas moléculas ou otimização do uso dos fármacosjáexistentes,visandooaumentodaefetividadedoarsenalterapêutico, diminuição do tempo de tratamento e redução dos efeitos adversos. Neste sentido, os objetivos do presente estudo foram: (I) Avaliar a necessidade de ajuste de dose de INH em populações adultas e pediátricas utilizando análises farmacométricas; e (II) avaliar a atividade antimicrobianadecompostosoxadiazólicoscontraM.tuberculosis,MNT,Gram-positivos e Gram-negativos, atividade combinatória com fármacos anti-TB, bem como sua citotoxicidade em células VERO e Hela. Os resultados estão apresentados em dois manuscritos: "New approaches in the treatment of resistant tuberculosis by PK/PD and pharmacogeneticsofIsoniazid"e"Antimicobacterialactivityofoxadiazolecompounds". No primeiro manuscrito o objetivo foi alcançado utilizando metodologia de modelos farmaco cinéticos e fisiológicos Drug Bank data base, PKsim®&MoBi™QSAR e PKsim8.0, respectivamente. Após essa etapa foi utilizado o software PKsim Standard para caracterização da população do estudo queincluem adulta e pediátrica caucasiana saudável. A partir do modelo PBPK foi desenvolvido e validado, o índice farmaco cinético/farmaco dinâmico ASC24h/MIC567 na cavidade pulmonar foi utilizado no cálculo através da Simulação de Monte Carlo para avaliar a probabilidade de alcance do objetivo farmacodinâmico. As posologias avaliadas para INH foram 300 mg/dia e 1.200 mg/dia em acetiladores rápidos e lentos em pacientes adultos. Na pediatria, foi avaliada a dose de10mg/kg/dia considerando também os fenótipos de acetilação da INH. Os resultados para a simulação da dose padrão de INH(300mg/dia) foram inapropriados para acetiladores rápidos, pois não foi atingido o alvo ASC/CIM 567 para qualquer valor de CIM, no entanto para acetiladores lentos a dose padrão o alvo farmaco dinâmico foi alcançado contra Mtbcom até CIM0,015mg/L. A simulação da dose 1.200 mg/dia em acetiladores rápidos alcançou o alvo farmaco dinâmico contra Mtb com CIM até 0,03 mg/L e na pediatria a dose de 10mg/kg/dia o alvo farmacodinâmico de ASC/CIM 567 foi alcançado em ambos perfis acetiladores, no entanto com valores de CIM muito baixos nos acetiladores rápidos. No segundo manuscrito, os ensaios in vitro Resazurin microtiter assay plate (REMA) e Resazurin Drugs Combination Microtiter Assay (REDCA) foram propostos para determinação da CIM e da combinaçãode compostos oxadiazólicos com isoniazida, rifampicina, etambutol (EMB) e pirazinamida frente a Mtb H37Rv e isolados clínicos de Mtb resistentes aos fármacos antituberculose de primeira linha. Foi avaliado também a atividade antimicrobiana frente a MNT e bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A citotoxicidade foi determinada em células HeLa e VERO pelo método de redução do MTT. A CIM variou de 3,9 a 31,2 µg/mL. A substância LMM11 mostrou-se a mais promissora para Mtb atingindo valores de índice de seletividade de 82,6 em célula Vero e apresentou efeito sinérgico quando combinado com INH e EMB em isolados clínicos resistentes. Por fim, conclui-se com este estudo a importância da individualização de doses de INH em indivíduos com fenótipo NAT2 e encorajam futuros estudos que possam elucidar o mecanismo de ação da molécula LMM6 e LMM11 como promissoras no tratamento da TB.

ABSTRACT: The increase in cases of resistance to drugs utilized to treat tuberculosis (TB) generally contributestotheworseningofthesituationworldwide.Thus,thesearchfornewmolecules, or to optimize the use of the existing drugs is urgent to increase effectiveness and the therapeuticarsenal,aswellastoreducetreatmenttimeandadverseeffects.Inthis sense,the present study aims to (I) evaluate the need for INH dose adjustment in adult and pediatric populations using pharmaco metric analyses,and to (II) evaluate the anti microbial activity of oxadiazolic compounds against M. tuberculosis, Nontuberculous Mycobacteria (NTM), Gram-positive and Gram-negative bacteria, incombination with anti-TB drugs, and their cytotoxicity in VERO and HeLa cells. The results are presented in two manuscripts: "New approaches in the treatment of resistant tuberculosis by PK/PD and pharmacogenetics of Isoniazid" and "Antimycobacterial activity ofoxadiazole compounds". In the first manuscript, the need for INH dose adjustment was assessed using pharmacokinetic and physiological model methodology, through the DrugBank database, PKsim® & MoBi ™ QSAR and PKsim 8.0. PKsim Standard software was used to characterize the studied population,composedofhealthyadultandpediatricCaucasianpatients.Fromthedeveloped and validated PBPK model, the AUC24h/MIC 567 pharmacokinetics/pharmacodynamic index in the pulmonary cavity was used in the calculation through the Monte Carlo Simulation to evaluate the probability of achieving the pharmacodynamic target. The evaluated dosages for INH were 300mg/day and 1,200mg/day, for adult patients, infast and slow acetylators. For pediatric patients, the dose of 10mg/kg/day was considered, accounting for the INH acetyation phenotypes. Theres ultsfor the simulation indicated that the standard dose of INH (300 mg/day) was inappropriate for fast acetylators, since the AUC/CIM567 target was not reached at any MIC value. However, for slow acetylators, the same dose achieved the pharmaco dynamictar get against Mtb, with MIC values higher than 0.015mg/L. The simulation of the 1,200 mg/day dose in fast acetylators reached the pharmaco dynamic target against Mtb with MIC above 0.03 mg /L, while in pediatric patients, the dose of 10 mg/kg/day achieved the target (ASC/MIC 567) for both profiles acetylators, but with very low MIC values for fast acetylators. In these cond manuscript, invitro tests, Resazurin

microtiter assay plate (REMA) and Resazurin Drugs Combination Microtiter Assay (REDCA), were proposed to determine MIC and the combination of two oxadiazolic compounds,LMM6 and LMM11,withi soniazid (INH), rifampicin (RIF), ethambutol (EMB) and pyrazinamide (PZA) against Mtb H37Rv and clinical Mtb isolates, resistant to first-line anti-tuberculosis drugs. Antimicrobial activity against NTM and Gram-positive and Gram- negative bacteria was also evaluated. Cytotoxicity was determined in HeLa and Vero cells by the MTT reduction method. MIC values ranged from 3.9 to 31.2 µg/mL. The substance LMM11 proved to have the most promising activity against Mtb, presenting a selectivity index of 82.6 in Vero cells, and synergistic effect when combined with INH and EMB in resistant clinical isolates. Finally, this study concludes the importance of individualizing INH doses inindividuals with NAT2 phenotype, and encourages future studies that may elucidate the mechanism of action of the LMM6 and LMM11 molecules as a promising candidate in the treatment of TB.