Otimização da síntese de glicoamilase por Aspergillus awamori NRRL 3112 em cultivo descontínuo de amido de milho dextrinizado

Abstract

RESUMO: A glicoamilase é uma enzima de grande importância nos processos industriais, assim, o estudo de otimização de seu processo de síntese, com substratos e microrganismos diferentes se torna cada vez mais relevante. Assim, o objetivo desta pesquisa foi aumentar a eficiência de produção da glicoamilase em cultivo submerso de Aspergillus awamori NRRL 3112 em sistema descontínuo empregando o amido de milho pré-sacarificado como substrato. O estudo foi estruturado em três fases. A primeira consistiu na retomada e aprofundamento dos resultados obtidos na dissertação de mestrado da autora. Em seguida, foram conduzidos ensaios exploratórios com o intuito de avaliar o efeito de fontes alternativas de nitrogênio e de diferentes concentrações de fosfato. A última etapa envolveu a aplicação de um planejamento experimental com sete variáveis independentes, cuja análise estatística permitiu identificar os fatores mais influentes sobre a síntese enzimática. Durante os ensaios preliminares, observou-se que maiores concentrações de substrato e nutrientes estavam associadas a um aumento na atividade enzimática, embora o consumo efetivo do substrato tenha se mantido em torno de 20 g/L. A substituição do extrato de levedura por água de maceração de milho (CSL) apresentou os melhores resultados, destacando-se como fonte de nitrogênio mais eficiente. A peptona de carne teve desempenho satisfatório, mas inferior à CSL, enquanto o leite em pó, embora tenha favorecido o crescimento celular, não impulsionou a produção de glicoamilase. A adição isolada de fosfato teve impacto modesto, mas, em combinação com CSL, contribuiu positivamente. Com base nas informações obtidas, foi desenvolvido um delineamento fatorial fracionado 2??³ com 19 experimentos, nos quais se variaram o pH, a temperatura, a concentração de substrato, CSL, fosfato, extrato de levedura e agitação. A atividade enzimática foi medida em três tempos distintos (42h, 72h e 96h). Os modelos ajustados apresentaram coeficientes de determinação superiores a 0,94, confirmando a adequação da metodologia. Foi possível observar que os fatores mais relevantes mudam conforme o tempo de cultivo. No início, pH e temperatura foram determinantes; no final, o destaque passou a ser a agitação, o extrato de levedura e o fosfato. Entre os experimentos, o que apresentou o melhor desempenho global foi o E16, que reuniu todos os fatores em seus níveis superiores. Esse ensaio atingiu uma variação de atividade enzimática de 2594,18 U/L e produtividade de 27,02 U/L·h. Os maiores rendimentos enzimáticos ocorreram sob condições de crescimento celular não tão acentuado, o que está de acordo com o perfil de metabólito secundário da glicoamilase. Diante desses resultados, concluiu-se que a associação entre CSL, alta concentração de substrato e fosfato, pH levemente ácido, agitação elevada e extrato de levedura proporcionou um ambiente favorável para a maximização da síntese enzimática. Essa combinação representou uma base promissora para aplicações industriais futuras e para estudos de escalonamento.

ABSTRACT: Glucoamylase is an enzyme of great importance in industrial processes; therefore, studies aimed at optimizing its synthesis using different substrates and microorganisms have become increasingly relevant. This research aimed to enhance the productive efficiency of glucoamylase in batch submerged cultivation of Aspergillus awamori NRRL 3112 using pre-saccharified corn starch as the main carbon source. The study was structured into three phases. The first consisted of revisiting and expanding upon the results obtained during the author's master's dissertation. Subsequently, exploratory experiments were conducted to evaluate the effects of alternative nitrogen sources and different phosphate concentrations. The final stage involved the application of an experimental design with seven independent variables, followed by statistical analysis to identify the most influential factors on enzymatic synthesis. During the preliminary experiments, it was observed that higher concentrations of substrate and nutrients were associated with increased enzymatic activity, although actual substrate consumption remained around 20 g/L. Replacing yeast extract with corn steep liquor (CSL) yielded the best results, emerging as the most effective nitrogen source. Meat peptone showed satisfactory but lower performance than CSL, while powdered milk, although promoting biomass growth, did not enhance glucoamylase production. The isolated addition of phosphate had a modest effect; however, when combined with CSL, it contributed positively. Based on the obtained insights, a fractional factorial design 2??³ was developed, comprising 19 experiments in which pH, temperature, substrate concentration, CSL, phosphate, yeast extract, and agitation were varied. Enzymatic activity was measured at three time points (42h, 72h, and 96h). The fitted models showed coefficients of determination greater than 0.94, confirming the adequacy of the applied methodology. It was found that the most relevant factors varied depending on the cultivation time. Initially, pH and temperature were decisive; by the end, agitation, yeast extract, and phosphate had become the most influential variables. Among the experiments, the one with the best overall performance was E16, which combined all variables at their highest levels. This trial achieved a variation in enzymatic activity of 2594.18 U/L and a productivity rate of 27.02 U/L·h. Interestingly, the highest enzymatic yields occurred under conditions of moderate biomass growth, aligning with the typical behavior of secondary metabolite production. Based on these results, it was concluded that the combination of CSL, high concentrations of substrate and phosphate, slightly acidic pH, intense agitation, and yeast extract provides a favorable environment for maximizing glucoamylase synthesis. This formulation offers a promising foundation for future industrial applications and scale-up studies.