Alvos moleculares na detecção e identificação de espécies de Leishmania

Abstract

Resumo: A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta da biologia molecular que apresenta várias vantagens para o diagnóstico, caracterização clínica e epidemiológica da leishmaniose. O objetivo do estudo foi; 1. Desenvolver iniciadores específicos para a identificação de espécies de Leishmania usando a técnica de multiplex PCR e 2, realizar uma revisão sistemática dos estudos que desenharam iniciadores para detectar espécies de Leishmania do Novo Mundo, relatando as características de cada alvo, limite de detecção, especificidade dos iniciadores e a sensibilidade diagnóstica. Foram desenhados quatro iniciadores, com base nas sequências GenBank do minicírculo de kDNA, amplificando 127 pb para o subgênero Viannia, 100 pb para L. amazonensis e 60 pb para o complexo L. donovani e L. major. O multiplex PCR não amplificou Trypanosoma cruzi ou L. mexicana. A alta sensibilidade da técnica foi confirmada pela detecção de parasitas em diferentes amostras biológicas. Na revisão sistemática, 50 estudos foram recuperados das bases de dados PubMed e Web of Science. Nosso trabalho aponta as vantagens e desvantagens dos principais alvos moleculares e iniciadores, oferecendo informações para que o pesquisador possa escolher o sistema de PCR mais adequado à necessidade da sua pesquisa. Vinte e um alvos diferentes foram usados para o desenho dos iniciadores, sendo o mais estudado, o alvo do minicírculo do kDNA. O minicírculo do kDNA é o alvo mais aplicado na pesquisa molecular para o diagnóstico, devido à alta sensibilidade em detectar Leishmania em diferentes amostras clínicas, característica que pode ser parcialmente atribuída ao maior número de cópias do minicírculo por célula. No entanto, devido à considerável heterogeneidade, o uso deste alvo pode levar à perda de precisão do ensaio, o que não é observado em outros alvos moleculares. Os outros alvos moleculares mostrados nesta revisão mostraram-se menos sensíveis ao uso diagnóstico devido ao menor número de cópias do gene alvo por célula, porém mais específicos para identificação de subgênero e/ou espécies. Estes alvos que apresentam regiões mais conservadas no gênero Leishmania, estão sendo explorados extensivamente no desenvolvimento de ferramentas moleculares que permitem a identificação de espécies.

Abstract: Polymerase chain reaction (PCR) is a tool of molecular biology that present several advantages for the diagnosis, clinical and epidemiological characterization of leishmaniasis. The objective of the present study was to design specific primers to the identification of Leishmania species using multiplex PCR and make a systematically reviewed the studies that designed the primers to detect New World Leishmania, reporting the characteristics of each target, detection limit, specificity of the primers designed and the diagnostic sensibility. Four primers were designed, based on the GenBank sequences of the kDNA minicircle, amplifying 127 bp for subgenus Viannia, 100 bp for L. amazonensis, and 60 bp for Leishmania donovani complex and L. major. Multiplex PCR did not amplify Trypanosoma cruzi or L. mexicana. The high sensitivity of multiplex PCR was confirmed by the detection of parasites in different biological samples. At the systematic review, the papers were identified in the databases PubMed and Web of Science and the study involved 50 studies. Our study points out the advantages and disadvantages of the main molecular targets and primers, offering information so researchers can choose the PCR system that is best suited to the needs of their research. Twenty-one different targets were used for the design of the primers, being the minicircle target of kDNA the most studied. Minicircle is the most applied target in molecular research for diagnosis, due to its high sensitivity in detecting Leishmania in different clinical samples, a characteristic that can be partially attributed to the higher number of copies of the mini-circle per cell. However, due to its considerable heterogeneity, the use of this target can lead to loss of precision in the assay, which is not observed in other molecular targets. The other molecular targets shown in this review were less sensitive to diagnostic use because of the lower number of copies of the target gene per cell, but more specific for identification of the subgenus and/or species. Targets that present more conserved regions in the genus Leishmania are being explored extensively in the development of molecular tools that allow the identification of species.